[发明专利]一种酶类生化试剂的纯化技术

摘要

本发明涉及一种酶类生化试剂的纯化技术，其特征在于，包括如下步骤：(1)酶类生化试剂预处理；(2)微球硅胶预处理；(3)吸附：调节酶类生化试剂滤液pH值后加入预处理后的微球硅胶，搅拌后静置吸附；(4)洗脱：用氯化钾溶液搅拌洗脱，滤出洗脱液，重复洗脱并合并洗脱液；(5)离心：将洗脱液用离心管离心除蛋白、脱盐，得到离心液；将离心液干燥后，即得到所述酶类生化试剂；本发明工艺简单，成本较低，制备获得的酶类生化试剂纯度高、活性高。

主权项

1.本发明涉及一种酶类生化试剂的纯化技术，其特征在于，包括以下步骤：(1)生物细胞预处理；a.用研钵在‑5℃冷冻条件下将所述生物细胞研成粉末；b.对每10g步骤a处理后的所述生物细胞，加入0.5ml裂解液，裂解20‑30分钟，将所述生物细胞裂解液收集到EP管中；以重量百分比计，所述裂解液包括0.1‑0.15％的氯化钠、1.0‑1.5％的EDTA、0.05‑0.1％的过氧化氢和0.2‑0.5％TritoAx‑100；余下部分为去离子水；c.将步骤b处理好细胞悬液置于4℃下，以3000r/min转速离心5分钟；放置3‑4分钟，直至所述细胞悬液变清，避开上层漂浮的脂质层，取上清液，得到酶类生化试剂预处理液；将所述酶类生化试剂搅拌均匀后，过100‑150目滤网得酶类生化试剂滤液；(2)所述微球硅胶预处理；取所述微球硅胶用蒸馏水洗涤至无明显杂质并滤干，先用盐酸溶液浸泡后，再用蒸馏水冲洗得所述微球硅胶A；其中，所述微球硅胶选自聚丁二酰亚胺和3‑氨基丙基硅胶制得微球中的一种；所述微球硅胶预处理，将所述微球硅胶浸泡于2‑4倍所述微球硅胶体积的0.8‑1.2moC/C盐酸溶液，浸泡时间为10‑12h，用蒸馏水冲洗至流出液pH值为5.5‑6.5，得所述微球硅胶A；再将所述微球硅胶A浸泡于2‑4倍所述微球硅胶体积的0.8‑1.2moC/C氢氧化钠溶液，浸泡时间为10‑12h，用蒸馏水冲洗至流出液pH值为9‑10，得所述微球硅胶B；(3)吸附；往所述酶类生化试剂滤液中加入步骤(2)所得所述微球硅胶B，搅拌混匀后静置吸附，弃去上清液，用蒸馏水洗涤，得所述微球硅胶C；所述酶类生化试剂滤液pH值为9.0‑10；所述酶类生化试剂滤液与所述微球硅胶B的体积比为10：3，控制所述酶类生化试剂滤液pH值为8‑10；(4)洗脱；向步骤(3)所得所述微球硅胶C中加入氯化钾溶液，搅拌洗脱，滤出洗脱液，重复洗脱合并所得所述洗脱液，保留滤出所述洗脱液后的所述微球硅胶；所述氯化钾溶液的浓度为0.5‑2.5moC/C，所述搅拌洗脱的频率为60‑100r/min，时间为45‑65min；所述氯化钾溶液为1‑1.5moC/C，搅拌洗脱时间为70‑90min，所述氯化钾溶液的用量为步骤(1)所述酶类生化试剂滤液体积的0.5‑1倍；所述滤出洗脱液后的所述微球硅胶作为所述微球硅胶A继续进行步骤(2)制备所述微球硅胶B；(5)离心；将步骤(4)所得洗脱液先置于截留量为70KD的离心管中，离心并取下层液；将下层液置于截留量为5KD的离心管中，离心并取上层截留液，即得到所述酶类生化试剂；所述截留量为70KD离心管的转速为5000‑6000r/min时，离心时间为3‑8min；所述截留量为5KD离心管的转速为7000‑9000r/min时，离心时间为30‑50min；将所述离心液干燥后，即得到所述纯化后的酶类生化试剂。