[发明专利]一种基于高通量测序的线粒体全基因组测序方法

摘要

本发明公开了一种基于二代测序的简单、经济、准确的线粒体全基因组barcode扩增测序方法。该发明设计了两组互相配合的引物，其中第一组引物由61对互相重叠并覆盖线粒体全基因的目标片段引物序列和引物接头序列组成，第二组引物由包含接头序列的，可以两两搭配的的正向和反向标签引物组成，用于标记不同来源的样本。通过两对引物的配合使用，在一次PCR反应中同时加入两对引物进行扩增，得到带标记的、长度合适的、包含线粒体全基因组的扩增子，混合后直接进行建库测序，实现多样本混合测序。测序数据应用生物信息学组装技术，同时识别头尾两端标记序列，将不同来源序列区分开来，得到所有样本的所有线粒体基因组序列信息。通过本方法的使用，简化测序实验步骤，大大降低测序成本，提高低频突变的检出率，为大样本的线粒体全基因组关联研究提供可能性。

主权项

1.一种基于高通量测序的线粒体全基因组测序方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)提取全血细胞总基因组DNA；(2)设计两组引物，其中第一组引物包含61对引物1，61对引物1覆盖线粒体全基因组，且均包含粘性接头，引物序列分别如SEQ ID NO.1～122所示；第二组引物，包含多个正向引物和相同数量的反应引物，任一正向引物可与任一方向引物进行配对，组成引物2；所述正向引物和反向引物均包含与第一组引物的粘性接头配对的粘性接头，用于标记不同样本；第二组引物中的正向引物包括SEQ ID NO.123～126，反向引物包括SEQ ID NO.127～130；(3)将多个不同来源的全血细胞总基因组DNA，利用交叉混合一步法分别进行PCR扩增，扩增子的长度不大于450bp；(4)将步骤3获得的所有扩增子混合纯化后使用Illumina Hiseq2500 PE250进行建库及测序；(5)测序数据进行分析。