[发明专利]表达CXCL10和CCL21趋化因子靶向嵌合抗原受体T淋巴细胞的构建方法及应用

摘要

本发明提供了一种表达CXCL10和CCL21趋化因子靶向嵌合抗原受体T淋巴细胞的构建方法，包括如下步骤：序列选取；构建含嵌合抗原受体的pCDH载体；将CXCL10及CCL21的DNA表达序列克隆进含嵌合抗原受体的pCDH载体中；慢病毒的包装；表达CXCL10和CCL21趋化因子靶向嵌合抗原受体T淋巴细胞的制备。本发明还提供了一种上述嵌合抗原受体T淋巴细胞在实体瘤免疫治疗方向上的应用。本发明以肿瘤特异性抗原为靶点，并辅助表达CXCL10和CCL21分子，既可实现对肿瘤细胞的靶向作用，又可抑制肿瘤血管生成，减少肿瘤组织的血液供应，最大程度杀伤实体瘤，实现了对实体瘤的免疫治疗新突破。

主权项

1.一种表达CXCL10和CCL21趋化因子靶向嵌合抗原受体T淋巴细胞的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)序列选取：选取CXCL10和CCL21作为目标序列；其中，CXCL10的DNA序列如SEQ ID NO:1所示，CXCL10的DNA序列如SEQ ID NO:2所示；(2)构建含嵌合抗原受体的pCDH载体：构建以实体瘤特异性抗原为靶点的嵌合抗原受体结构，整个嵌合抗原受体结构由识别上述实体瘤特异性抗原分子的scFv片段、CD8跨膜区、4‑1BB/CD137片段、CD3ζ片段依次顺序连接组成；在上述嵌合抗原受体结构序列的两端加入酶切位点粘性末端，克隆进入pCDH载体中，得含嵌合抗原受体的pCDH载体；(3)将CXCL10及CCL21的DNA表达序列克隆进含嵌合抗原受体的pCDH载体中：直接将CXCL10及CCL21表达序列进行合成后，克隆进入含嵌合抗原受体的pCDH载体，接着对其进行酶切，随后转染DH5α大肠杆菌，进行载体扩增并通过酶切与PCR测序鉴定，最终获得含CXCL10、CCL21DNA表达序列及嵌合抗原受体的pCDH载体；(4)慢病毒的包装：先培养293T细胞，再使用Opti‑MEM作为转染试剂，通过慢病毒包装体系中的质粒与步骤(3)得到的含CXCL10、CCL21DNA表达序列及嵌合抗原受体的pCDH载体来共转染293T细胞；培养一段时间后，进行病毒的收集，并通过超速离心进行浓缩与纯化；(5)表达CXCL10和CCL21趋化因子靶向嵌合抗原受体T淋巴细胞的制备：在获取供者的抗凝外周血后，离心去除血浆，获取血细胞，再通过Ficoll试剂进行单个核细胞PBMC的分离后，再转移至CD3/CD28anti‑body负载预处理的培养瓶使用含有IL2的KBM581培养基进行培养；其中，在培养的第2‑4天，加入步骤(4)制得的慢病毒进行感染，即可获得目标所需的表达CXCL10和CCL21趋化因子靶向嵌合抗原受体T淋巴细胞。