[发明专利]一种以甘油为碳源制备氧化葡萄糖酸杆菌全细胞的方法

摘要

本发明公开了一种以甘油为碳源制备氧化葡萄糖酸杆菌全细胞的方法，是对野生型氧化葡萄糖酸杆菌进行基因工程改造，使其能以甘油为碳源生长，制得重组氧化葡萄糖酸杆菌Gluconobacter oxydansΔGOX1068ΔGOX0854，然后将制得重组氧化葡萄糖酸杆菌接种于甘油无机盐培养基中，于30±1℃摇床振荡培养后获得。实验证实，本发明的方法中全细胞制备过程简便，制备的全细胞生物催化剂与以山梨醇复杂培养基中制备的氧化葡萄糖酸杆菌原始菌Gluconobacter oxydans 621H全细胞生物催化剂催化效率相当，且生物催化剂制备成本较低，具有良好的应用价值。

主权项

1.一种以甘油为碳源制备氧化葡萄糖酸杆菌全细胞的方法，步骤是：(1)对野生型氧化葡萄糖酸杆菌进行基因工程改造，使其能以甘油为碳源生长，制得重组氧化葡萄糖酸杆菌；(2)将制得重组氧化葡萄糖酸杆菌划线到含有质量体积比为1.5～1.8％琼脂并含50μg/mL头孢西丁的山梨醇复杂培养基平板上，于30±1℃摇床振荡培养36±1小时；(3)在无菌的条件下，用无菌的牙签分别挑取步骤(2)平板上的单菌落，然后接种到5mL的含50μg/mL头孢西丁的山梨醇复杂培养基中，于30±1℃摇床振荡培养36±1小时，获得重组氧化葡萄糖酸杆菌一级种子；(4)在无菌的条件下，取步骤(3)所得的一级种子菌液，以体积比为2～4％的接种量接种到50mL的山梨醇复杂培养基中，于30±1℃摇床振荡培养36±1小时，获得重组氧化葡萄糖酸杆菌二级种子菌液；(5)在无菌条件下，将步骤(4)得到的重组氧化葡萄糖酸杆菌二级种子菌液8,000±500转/分钟离心2～5分钟，用0.85％生理盐水洗涤菌体2～3遍，然后再将菌体悬起到生理盐水中得到重组氧化葡萄糖酸杆菌菌液，按菌液终浓度OD600nm为0.1的接种量将重组氧化葡萄糖酸杆菌接种到100mL甘油无机盐培养基中，于30±1℃摇床振荡培养36±1小时，获得氧化葡萄糖酸杆菌培养物；(6)将步骤(5)培养获得的氧化葡萄糖酸杆菌培养物6,000±500转/分钟离心10～15分钟；并用pH 7.4、1/15M的磷酸盐缓冲液洗涤菌体2～3遍，然后将细胞悬起到所述磷酸盐缓冲液中，使菌体细胞的终浓度OD600nm为30～50，即获得用于生物催化剂的氧化葡萄糖酸杆菌全细胞菌液；其中：上述步骤(2)～(3)中所述山梨醇复杂培养基的配方是：山梨醇73g/L，酵母粉18.4g/L，(NH4)2SO4 1.5g/L，KH2PO4 1.5g/L，MgSO4·7H2O 0.47g/L；121℃灭菌20分钟；上述步骤(5)中所述甘油无机盐培养基的配方是：(NH4)2SO4 2g/L，KH2PO4 2.2g/L，Na2HPO4 0.2g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，金属离子溶液(50×)20mL，121℃灭菌20分钟；甘油2g/L，121℃单独灭菌20分钟；维生素(100×)溶液10mL，过滤除菌；其中，金属离子溶液(50×)的配方为：硝基三乙酸0.25g/L，EDTA 1.5g/L，FeSO4·7H2O 0.55g/L，ZnSO4·7H2O 0.45g/L，CoCl2·6H2O 0.03g/L，MnCl2·4H2O 0.1g/L，CuSO4·5H2O 0.03g/L，CaCl2·2H2O 0.45g/L，NaMoO4·2H2O 0.004g/L，H3BO3 0.05g/L，KI 0.01g/L；维生素(100×)溶液的配方为：泛酸钙0.05g/L，烟酸0.04g/L，对氨基苯甲酸0.04g/L，谷氨酰胺20g/L。