[发明专利]一种羊踯躅提取物的抗炎活性检测方法和应用

摘要

本发明涉及羊踯躅提取物的抗炎活性检测方法和应用，包括建立羊踯躅提取物的制备方法，构建羊踯躅提取物抗炎活性细胞检测模型，建立羊踯躅提取物抑制炎症细胞中炎症因子及相关基因表达的分析方法。本发明结果显示，羊踯躅叶片甲醇提取物有较强的抗炎活性，能够明显抑制由脂多糖(LPS)刺激的RAW264.7细胞中一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子‑α(TNF‑α)和白介素1β(IL‑1β)等炎症因子的分泌及其基因的表达，也显著抑制炎症相关通路中两个关键酶基因iNOS和COX‑2的表达。

主权项

1.一种检测羊踯躅提取物抗炎活性的方法，包括以下步骤：(1)将新鲜的羊踯躅叶片清洗干净，冷冻干燥后粉碎，得到羊踯躅叶片粉末；用甲醇溶液回流提取羊踯躅叶片粉末，得到羊踯躅叶的甲醇提取液；将羊踯躅叶的甲醇提取液过滤，再将滤液用旋转蒸发仪在45～50℃条件下浓缩成膏状，然后将浸膏冷冻干燥成粉末，用二甲亚砜将粉末溶解，得到羊踯躅提取物；(2)羊踯躅提取物的用药浓度评估：将处于对数生长期的RAW264.7细胞接种于孔板中孵育12小时，再用不同浓度的羊踯躅提取物处理并再培养24小时；然后检测羊踯躅提取物对RAW264.7细胞的细胞毒性作用，从而得出不同浓度的羊踯躅提取物对RAW264.7细胞的毒性；(3)羊踯躅提取物抗炎活性的细胞检测模型构建及一氧化氮浓度测定：将处于对数生长期的RAW264.7细胞接种于孔板中，培养12小时后去上清；加入含有脂多糖的DMEM培养基刺激RAW264.7细胞建立炎症模型；2小时后加入不同浓度的羊踯躅提取物，孵育24小时，检测培养液中一氧化氮的浓度，从而得出羊踯躅提取物对一氧化氮的抑制率；(4)羊踯躅提取物抑制炎症因子的分析：将处于对数生长期的RAW264.7细胞接种于孔板中孵育12小时；加入脂多糖与RAW264.7细胞共培养，2小时后加入不同浓度的羊踯躅提取物共培养24小时；测定细胞培养液中肿瘤坏死因子‑α和白细胞介素‑1β的浓度，从而得出羊踯躅提取物抑制RAW264.7细胞分泌的炎症因子活性；(5)羊踯躅提取物抑制炎症相关基因表达的分析：将处于对数生长期的RAW264.7细胞接种于孔板中孵育过夜；并用脂多糖预处理细胞2小时，然后用不同浓度的羊踯躅提取物处理细胞12小时；收集细胞并提取细胞总RNA，反向转录RNA，对基因表达水平进行定量，用β‑actin基因的表达水平进行归一化，并计算基因的表达水平，从而得出羊踯躅提取物抑制炎症相关基因表达的情况。