[发明专利]一种昙花组培脱毒育苗的方法

摘要

本发明涉及植物组织培养技术领域，具体提供了一种昙花组培脱毒育苗的方法，包括如下步骤：（1）昙花植株的选择与循环热处理，（2）外植体消毒与茎尖剥离，（3）愈伤组织诱导培养，（4）愈伤组织分化培养，（5）病毒检测。本发明提供的方法能够避免昙花常规繁殖方法易感病毒导致品种退化的问题，而且茎尖成活率高、愈伤组织诱导分化效果好、脱毒率高，从而能大大提高昙花脱毒种苗培育的成功率，利于满足市场需求。

主权项

1.一种昙花组培脱毒育苗的方法，其特征在于，包括以下操作步骤：（1）昙花植株的选择与循环热处理：选取生长健壮、无病虫害的昙花植株，放入培养室内，每日于36～38℃、2000‑2200Lux光照条件下培养10～12小时，然后于22~25℃、黑暗条件下培养12~14小时，再回到36~38℃环境，如此循环培养 30~35天；（2）外植体消毒与茎尖剥离：取步骤（1）中植株，切取其枝梢含生长点的长 2cm幼嫩茎段，先蘸少量洗涤液用手轻轻搓洗2~3次，再用流水冲洗30~60 min后，将该茎段转移至超净工作台上，首先采用体积分数为75%的酒精消毒3~5min，然后采用质量分数为0.5%的新洁尔灭+2滴S106杀菌剂消毒10min，再采用质量分数为0.6%的邻苯二甲醛+2‑3滴吐温‑80/升灭菌液消毒10min，最后用无菌滤纸吸干表面水分；在无菌操作环境中用解剖刀切取保留自茎尖起0.5cm的茎段，放在0.6%的邻苯二甲醛中处理20s后，将其放在 75%酒精中消毒处理10s，再用无菌水反复冲洗3遍，沥干水分；再用灭过菌的刀片、镊子在无菌培养皿内把其茎段切成0.4~0.5mm的小颗粒，这些小颗粒为茎尖组织；（3）愈伤组织诱导培养：将上述获得的茎尖组织快速接种到愈伤组织诱导培养基中，每个组织培养瓶中放入3~5个茎尖组织颗粒，封好瓶口放入人工气候培养箱中，培养条件为温度20~25℃、相对湿度55~65%、1000‑1500Lux每天光照10~12小时，培养30~40天可获得黄绿色颗粒状的愈伤组织；（4）愈伤组织分化培养：将步骤（3）获得的新鲜愈伤组织在无菌条件下切成大小一致的小块，转入愈伤组织分化培养基中继续培养，培养箱温度控制为22~26℃、光照强度控制为1000‑1500Lux、相对湿度控制为55~65%、每天光照12~14小时，培养13~16天后愈伤组织可陆续分化出丛生的不定芽，再培养18~21天芽苗株高长至2~3cm时即为获得的试管苗；（5）病毒检测：采用酶联免疫吸附法（ELISA）对上述获得的试管苗苗进行病毒检测，若检测合格即为昙花脱毒种苗。