[发明专利]一种靶向HER2的CAR-T细胞的制备方法及应用

摘要

本发明公开了一种基因编辑的可分泌细胞因子或抗体的CAR‑T细胞制备方法及其用途。一种制备CAR‑T细胞的方法，是将包含基因编辑质粒及CAR修饰的质粒载体转染至T细胞。本发明的CAR‑T细胞通过基因编辑及基因修饰将T细胞表面负调节基因敲除并将识别肿瘤细胞表面抗原的单链抗体、分泌细胞因子或分泌抗体的表达框整合到T细胞，并能在T细胞中持续表达，使回输的T细胞避免被肿瘤微环境所抑制，对肿瘤细胞起到更好的杀伤作用。

主权项

1.一种制备敲除了目标基因且能分泌功能蛋白的靶向特定抗原的CAR‑T细胞的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)准备PBMC细胞、并分选富集CD3阳性T细胞；(2)将BE3质粒、sgRNA质粒和引入了编码功能蛋白基因的CAR质粒共转染步骤(1)制得的CD3阳性T细胞后，得转染后的CD3阳性T细胞；(3)在步骤(2)制得的转染后的CD3阳性T细胞中加入IL‑2和CD3/CD28免疫磁珠，激活T细胞；(4)收集步骤(3)激活的T细胞，并进行基因型分析验证，即可制得敲除了目标基因且能分泌功能蛋白的靶向特定抗原的CAR‑T细胞；所述的目标基因为T细胞基因中的人PD1、LAG3、TIGIT、VISTA、2B4或CD160中的任意一种；所述的特定抗原为CD19、CD20、CD23、CD30、CD33、CD123、CD133、PSMA、HER2、VEGF、MSLN、MUC1、GPC3、CEA、EGFRVIII或c‑met中的任意一种；所述的功能蛋白为细胞因子或者抗体；所述的抗体是免疫检查点抑制剂抗体，针对以下抗原中的任意一种：PD‑1、PD‑L1、CTLA4、LAG3或TIM3；所述的细胞因子为IL12，IL18或IL15中的任意一种；所述的sgRNA质粒为含有sgRNA序列的质粒，具体的，所述的sgRNA序列为以下序列，其中粗体下划表示PAM，斜体下划表示候选突变编码子：针对人PD1(hPD‑1)sgRNA为：SEQ ID NO.1:SEQ ID NO.2:SEQ ID NO.3:针对人LAG3(hLAG3)sgRNA为：SEQ ID NO.4:SEQ ID NO.5:SEQ ID NO.6:针对人TIGIT(hTIGIT)sgRNA为：SEQ ID NO.7:针对人VISTA(hVISTA)sgRNA为：SEQ ID NO.8:针对人2B4 sgRNA为：SEQ ID NO.9:针对人CD160(h CD160)sgRNA为：SEQ ID NO.10: