[发明专利]一种在兰花中实现基因瞬时表达的方法

摘要

本发明公开了一种在兰花中实现基因瞬时表达的方法。该方法主要包括以下步骤：表达载体的构建、含有目标基因的农杆菌转化培养、侵染液的制备和农杆菌注射法导入目标基因。并对农杆菌侵染后的表型鉴定，结果表明：含有pUN1301‑PeAP3质粒的农杆菌液注射植株中PeAP3基因的表达量提高；而含有pUN1301‑eGFP质粒的农杆菌液注射植株中可持续4周检测到荧光信号，对表型的影响持续时间为2‑4个月。本发明利用农杆菌侵染法在兰花活体材料中实现目标基因瞬时高表达，避免了兰科植物遗传转化体系不成熟的问题，最大程度节省了转化周期和成本，可用于兰科植物分子生物学研究中批量进行基因功能鉴定，多基因相互作用分析等。

主权项

1.一种在兰花中实现基因瞬时表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)表达载体的构建：将目标基因克隆至pMD19‑Tvector载体，经测序确认后，使用双酶切，回收纯化目的片断，并连接到经过同样两个酶的酶切，纯化的pUN1301质粒载体，得到含有目标基因的pUN1301质粒；(2)含有目标基因的农杆菌转化培养：采用冻融法将步骤(1)得到的含有目标基因的pUN1301质粒导入农杆菌感受态细胞，加入LB培养液培养4～6h，离心弃上清，用LB培养液重悬沉淀，得混合物；将混合物涂板到含有抗生素的LB板上，培养48～72h，待长出菌落后再挑菌重新划线以确保是单克隆，得到含有目标基因的农杆菌；(3)侵染液的制备：将含有目标基因的农杆菌，加入含有抗生素的LB培养液，培养直至菌液OD＝0.5～1.0，将菌液离心，弃上清，用重悬液重悬至菌液OD＝0.3～0.5，得侵染液；(4)农杆菌注射法导入目标基因：将步骤(3)得到的侵染液导入兰花花芽，然后进行正常的光温水肥管理。