[发明专利]重组减毒鼠伤寒沙门氏菌pcDNA3.3c-Caspase-3-Gala-VNP20009的构建方法及功能验证方法

摘要

本发明公开了Caspase‑3重组单链抗体的构建及功能验证的方法：包括以下步骤(1)构建pcDNA3.3c‑Caspase‑3‑Gala重组质粒；(2)构建pcDNA3.3c‑Caspase‑3‑Gala减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009重组菌株；(3)Caspase‑3重组质粒通过减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009胞内侵袭的特性,侵入细胞后实现蛋白Caspase‑3的真核表达，验证这种蛋白对细胞的杀伤作用。本发明中采用减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009的胞内侵袭的特性实现人源毒素蛋白的表达，同时大量研究表明减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009能够特异性聚集在实体肿瘤中，可以实现特异性杀伤肿瘤细胞的目的，为肿瘤治疗研究提供实验依据。

主权项

1.Caspase‑3重组单链抗体的构建及功能验证的方法，其特征是，所述构建方法包括如下步骤：(1)获取Caspase‑3‑Gala片段以pET302‑Caspase‑3‑Gala为模板，以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4序列为引物，PCR扩增获得SEQ ID No.1所示的Caspase‑3‑Gala片段；(2)构建pcDNA3.3c‑Caspase‑3‑Gala重组质粒：将步骤(1)中获得的Caspase‑3‑Gala片段，通过酶切酶连的方法连接到pcDNA3.3c其序列为：SEQ ID No.2质粒中，重组质粒命名pcDNA3.3c‑Caspase‑3‑Gala；(3)构建pcDNA3.3c‑Caspase‑3‑Gala重组菌株：将步骤(2)中的pcDNA3.3c‑Caspase‑3‑Gala重组质粒转入E.coli Top10中，获得重组菌株；(4)构建pcDNA3.3c‑Caspase‑3‑Gala重组减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009：从步骤(3)中获得的重组菌株中获得重组质粒后，通过电转化的方法置于鼠伤寒沙门氏菌VNP20009中，电转条件：1800V、25uF、200Ω、4.7ms，将重组后的鼠伤寒沙门氏菌命名为pcDNA3.3c‑GrB‑Caspase‑3‑Gala‑VNP20009。