[发明专利]一种人工毛乳头样细胞的获取方法

摘要

本发明公开了一种人工毛乳头(dermal papilla,DP)样细胞的获取方法，包括以下步骤：1)配制海藻酸钠和D‑甘露醇混合溶液，过滤除菌；2)提取人真皮成纤维细胞并体外大量培养；3)经静电喷雾法得到包裹人真皮成纤维细胞的海藻酸钠微球；4)对海藻酸钠微球处理得到APA微球；5)APA微球体外培养将人真皮成纤维细胞诱导为人毛乳头样细胞。本发明采用海藻酸钠微球包裹人真皮成纤维细胞以模拟DP细胞在人体内聚集生长的特性，通过该方法使人真皮成纤维细胞向人毛乳头细胞方向发生转分化，得到大量具有诱导毛发生成能力的人毛乳头样细胞，有效解决了人毛乳头细胞难获取并且在体外培养易丢失生物活性的问题。

主权项

1.一种人工毛乳头样细胞的获取方法，包括以下步骤：1)提取并体外培养人真皮成纤维细胞，选取10代内的人真皮成纤维细胞；2)按质量体积比分别配制0.8％‑2％g/ml的海藻酸钠溶液和5％‑15％g/ml的D‑甘露醇溶液，在室温下充分混合溶解，然后过滤除菌，得到无菌的海藻酸钠‑甘露醇水溶液，以下简称海藻酸钠溶液；3)将人真皮成纤维细胞悬浮于2)配置好的海藻酸钠溶液中，形成细胞悬浮液，使每毫升悬浮液中至少含有2×106个人真皮成纤维细胞；4)采用静电喷雾的方法将3)中的细胞悬浮液打散形成微滴，滴入质量体积浓度为1‑2％g/ml的氯化钙溶液中获得稳定包裹人真皮成纤维细胞的海藻酸钠水凝胶微球；控制细胞悬浮液推进泵的流速为1‑3ml/h，控制静电发生装置的电压为5‑6kV，控制静电喷雾的时长在20min以内；5)将4)所述的海藻酸钠微球依次用0.4‑0.6mg/ml多聚赖氨酸在25‑37℃的条件下处理10‑15min，0.08％‑0.2％g/ml海藻酸钠溶液处理4‑10min，5‑6mM柠檬酸钠溶液处理3‑5min，最终得到海藻酸钠‑多聚赖氨酸‑海藻酸钠复合微球，以下简称APA微球；6)将APA微球在DMEM培养基中培养5‑16天，人成纤维细胞逐渐被诱导为人工毛乳头样细胞。