[发明专利]高效液相色谱法测定婴幼儿营养强化奶粉中核苷酸含量的方法

摘要

本发明公开了高效液相色谱法测定婴幼儿营养强化奶粉中核苷酸含量的方法，它采用了碱性磷酸酯酶水解核苷酸得到核苷，采用了硼酸凝胶净化技术进行净化后，建立一种硼酸基亲和凝胶对复杂基质样品中核苷进行吸附清洗后，再将目标核苷释放出来，达到了富集和净化目的，从而排除基质的干扰能够准确的测定核苷的含量，从而间接准确测得核苷酸的含量，在检测过程中采用了内标法进行定量，进一步的提高了定量的准确性，该方法准确度高、净化效果明显、重复性好，该方法适用于各种基质复杂的营养强化婴幼儿乳粉中核苷酸的准确检验。

主权项

1.高效液相色谱法测定婴幼儿营养强化奶粉中核苷酸含量的方法，其特征在于包括如下步骤：1）标准储备液的配制核苷标准储备液：准确称取20mg各核苷分别加入相应的20mL容量瓶中，用50%甲醇水溶解定容，得到1.0 mg/mL各核苷标准储备液，于2‑8℃下储存；核苷酸标准储备液：准确称取20mg各核苷酸分别加入相应的20mL容量瓶中，用50%甲醇水溶解定容，得到1.0 mg/mL各核苷酸标准储备液，于2‑8℃下储存；2）混合中间标准液的配制核苷混合中间标准液：用移液管分别移取2mL步骤1）中的各核苷标准储备液至相应的10mL容量瓶中，用纯水定容，并充分混合得到得核苷混合中间标准液，于2‑8℃下储存；核苷酸混合中间标准液：用移液管分别移取2mL步骤1）中的各核苷酸标准储备液至相应的10mL容量瓶中，用纯水定容，并充分混合，于2‑8℃下储存；3）内标储备液的配制准确称取20mg 5‑甲基胞嘧啶核苷和20mg 1‑甲基鸟嘌呤核苷于20 mL容量瓶中，用50%甲醇水溶解定容，得到内标储备液，于2‑8℃下储存；4）工作内标液的配制移取2mL步骤3）的内标储备液到10mL容量瓶中，用纯水定容，得工作内标液，于2‑8℃下储存；5）混合工作标准液：用移液管分别移取0.050 mL、0.10 mL、0.25 mL、0.5 mL和1.0 mL步骤2）中的核苷混合中间标准液至5个相应的独立25mL容量瓶中，且在每个容量瓶分别加入0.5 mL步骤4）的工作内标液，再向每个容量瓶中添加6.25mL的1M磷酸，用纯水定容，并充分摇动混合后，分别转移到自动进样器瓶内待HPLC分析； 6）样品溶液的配制6.1）碱性磷酸酶溶液的配制将0.02 ml碱性磷酸酶用5.0 mL 0.5 M醋酸铵完全溶解，得到碱性磷酸酶溶液，在4℃冰箱保存备用；所配制的溶液中碱性磷酸酶溶液含量为12个单位/50 μL；6.2）Affi‑gel 601胶浆体的配制准确量取50 mL的0.1 M磷酸钾于100 mL烧杯中，放入磁力搅拌棒置于搅拌器上搅拌，并加入5g Affi‑gel 601胶搅拌均匀，盖上金属铝箔，持续搅拌4个小时后完全转移至100mL离心管中2000 r/min离心3 min，吸取上清液弃掉后得凝胶；用50 mL 0.25M磷酸冲洗并强力涡旋重悬凝胶，2000 r/min离心3 min，吸取上清液弃掉；所得凝胶中加入50 mL 0.25M磷酸钾，强力涡旋离心管重悬凝胶，2000 r/min离心3 min，弃去上清液，再向凝胶中准确加入75 mL 0.25M磷酸钾，强力涡旋离心管分散凝胶，得到Affi‑gel 601胶浆体，将Affi‑gel 601胶浆体分别按1.0 mL的量装入带有扣盖的2.0 mL小离心管中密封保存备用；6.3）样品前处理准确称取15 g奶粉，用50℃温水充分溶解并定容100 mL，准确移取5.0mL于25.0mL离心管中，加入3 mL水涡旋3min混匀，准确加入500 µL步骤4）的工作内标溶液、1 mL 0.5M醋酸铵、50µL浓氨水、50µL 1M MgCl2、50µL 10 mM ZnSO4和50 μL步骤6.1）的碱性磷酸酶溶液，混匀后，在35‑39℃的恒温摇床中以150 r/min振荡2小时，取出离心管加入12.5mL的0.5M磷酸钾后用纯水稀释至25mL刻度，加盖，摇动混合，得待净化样品液；6.4）样品净化取步骤6.2）的装有1.0mL Affi‑gel 601胶浆体的2.0 mL小离心管，2000 r/min离心2 min后弃去上清液，准确加入步骤6.3）的待净化样品液1.0 mL后加盖涡旋30 min，再于100 r/min振荡器中振荡15分钟，2000 r/min离心2 min，弃去上清液；加入1 mL 0.25M磷酸钾缓冲液，涡旋离心管使Affi‑gel 601胶浆体分散，2000 r/min离心2 min，弃去上清液，重复清洗1次，2000 r/min离心2 min，弃去上清液得凝胶；向凝胶中加入250µL 1M磷酸，强力涡旋离心管10秒分散凝胶并释放出核苷，打开离心管，加入750 µL 0.1M磷酸，涡旋离心管8‑12秒，得样品溶液，用0.22 µm HPLC有机滤膜将样品溶液直接过滤入HPLC小瓶中待HPLC分析；7）用高效液相色谱法测定步骤5）的混合工作标准液，测得各分析物的峰面积，其中尿嘧啶核苷、次黄嘌呤核苷、胞嘧啶核苷和腺嘌呤核苷采用5‑甲基胞嘧啶核苷作为内标物，鸟嘌呤核苷采用1‑甲基鸟嘌呤核苷作为内标物，各核苷的峰面积与相应内标物的比值（Y）为纵坐标，质量浓度（X）为横坐标绘制标准曲线；8）用高效液相色谱法测定步骤6）的净化后的样品溶液，测得各分析物的峰面积，其中尿嘧啶核苷、次黄嘌呤核苷、胞嘧啶核苷和腺嘌呤核苷采用5‑甲基胞嘧啶核苷作为内标物，鸟嘌呤核苷采用1‑甲基鸟嘌呤核苷作为内标物，测得各核苷的峰面积与相应内标物的比值代入步骤7）的标准曲线中，获得各核苷组分的质量浓度；通过公式（1）和公式（2）计算得出样品中核苷酸的总量：X ‑样品中核苷酸的总量，单位为g/kg；Xi ‑样品中核苷酸各组分的含量，分别是：XCMP、X UMP、XGMP、XIMP、XAMP，单位为g/kg；Ci‑样品溶液中核苷各组分的质量浓度，单位为mg/L；Vi ‑样品溶液的体积，单位为mL；n ‑样品稀释倍数；fi‑各核苷‑核苷酸转化系数；mi ‑样品的质量，单位为g。