[发明专利]一种金龙胆草离体细胞的培养方法

摘要

本发明公开了一种金龙胆草离体细胞的培养方法，包括以下步骤：外植体的选择与灭菌；金龙胆草叶片单细胞分离；建立金龙胆草悬浮细胞系；稳定继代培养。本发明周期较组织培养更短，同时不需要栽培金龙胆草，不受地理因素限制。

主权项

1.一种金龙胆草离体细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、外植体的选择与灭菌：采集幼嫩且叶表面积相对较大的新叶作为备用外植体；在超净工作台中，将外植体于无菌水下冲洗，用无菌滤纸吸干残留水份；将处理后的叶片转入70％酒精浸泡10s‑30s，取出后立即用大量无菌水冲洗3‑5遍，然后放入0.1％HgCl2浸泡6‑10min，结束后立即用大量无菌水冲洗3‑5遍，之后将外植体放在无菌滤纸上吸干水份，并用无菌手术刀将叶脉切掉；步骤2、金龙胆草叶片单细胞分离：用70％酒精喷施牛肚匀浆器灭菌，带酒精挥发干后，备用；采用机械法分离单细胞，将处理好的叶片转入含有STN缓冲液的无菌牛肚匀浆器中，快速研磨匀浆；过无菌细胞筛，收集金龙胆草离体单细胞；步骤3、建立金龙胆草悬浮细胞系：吸取机械分离得到的细胞液，接种于悬浮细胞培养液中，接种后的培养液置于摇床中培养，采用SCAR鉴定该悬浮细胞是否为金龙胆草悬浮细胞；步骤4、稳定继代培养：吸取鉴定为金龙胆草亲代悬浮细胞系，转入新的培养液中培养3天。