[发明专利]一种基于免疫印迹法检测古代毛织品残片的方法

摘要

本发明涉及文物检测领域，公开了一种基于免疫印迹法检测古代毛织品残片的方法，本发明先制备了碳量子点标记的羊毛二抗，之后用金属盐法和还原法提取现代羊毛和古代毛织品残片，进行SDS‑PAGE凝胶电泳，用碳量子点溶液进行染色，观察电泳图像。将得到的蛋白条带转移到聚偏氟乙烯膜上，经羊毛一抗和碳量子点标记的二抗孵育后，可在凝胶成像系统中观察到免疫条带，鉴定古代毛织品。本发明中化学试剂用量少，反应温和、环保无害；在对古代毛织品进行检测时，具有样品用量少、灵敏、准确、直观等优点。

主权项

1.一种基于免疫印迹法检测古代毛织品残片的方法，其特征在于包括以下步骤：1）碳量子点的制备：将水和十二烷基苯磺酸钠加入到正戊烷中，制得油相溶液；加入生物质焦油水溶液、正丙醇和十二烷基苯磺酸钠，振荡得到反相微乳液；加入十二胺，超声，马弗炉中保温，冷却，破乳，离心，制得碳量子点溶液；然后取一半经透析纯化、冷冻干燥，得到碳量子点；2）碳量子点标记羊毛角蛋白二抗的制备：将碳量子点、碳化二亚胺和二抗加入到9‑11mmol/L的磷酸缓冲盐溶液中，在室温条件下搅拌2‑3 h后，用磷酸缓冲盐溶液对溶液进行多次洗涤离心，得到碳量子点标记羊毛角蛋白二抗；3）用酒石酸将0.03‑0.06 mol/L的酒石酸钠溶液的pH调为2.5‑2.8，将此溶液与350‑450μl步骤1）剩余的碳量子点溶液混合均匀，制得碳量子点染胶溶液；4）分别称取古代毛织品样品和现代羊毛样品，用去离子水清洗，烘干；分别浸在pH =1.5‑2.5的HBr溶液中1‑2h，用去离子水搓洗，烘干；以1：15‑25的浴比加入含有0.05‑0.15mol/L的LiBr和0.02‑0.04mol/L的十二烷基硫酸钠的溶液中浸没，调节pH为8‑11，超声，放入微波反应器辐射水解6‑8min；5）从反应器中取出，将两个样品分别倒入三口烧瓶，将三口烧瓶放在恒温水浴锅中，调节水浴温度70‑90℃，通氮气10‑20分钟，缓缓加入10‑25ml的2.5‑3.5 mol/L 三(2‑羧乙基)膦溶液，通氮气搅拌，使羊毛溶解，真空抽滤，去除未溶羊毛及杂质；6）分别加入20‑35g硫酸铵，搅拌均匀，调节滤液pH，离心8‑15min，将下层溶液在2‑6℃条件下用透析袋透析50‑60h；低温真空浓缩至原体积的1/4‑1/2，得到羊毛角蛋白提取液A、B；7) SDS‑PAGE凝胶电泳：取羊毛角蛋白提取液A、B于2*样品缓冲液按1∶0.8‑1.2比例混合，水浴加热于93‑97℃下加热1.5‑2.5 min，使蛋白质变性；冷却至室温后，分别取羊毛角蛋白提取液各 10‑20μl加入凝胶点样孔，进行SDS‑PAGE凝胶电泳；浸入步骤3）所得碳量子点染胶溶液，以低速在摇床上振荡2.5‑3.5h，观察样品的电泳图像；8）电转移：将电泳后的胶平铺在经甲醇和电转缓冲液处理过的聚偏氟乙烯膜上，夹在滤纸和海绵中间组装成转运夹层，放入湿式转膜装置中，恒流转膜；9）膜成像：电转移完成后，取出聚偏氟乙烯膜，放入凝胶成像系统中成像，观察蛋白条带转移情况；10）封闭：取出聚偏氟乙烯膜，用10‑20mL的三乙醇胺缓冲盐水溶液洗膜4‑6min，用封闭液在室温条件下处理50‑70min；11）免疫处理：用抗体稀释液以950‑1050:1的体积比稀释一抗，将膜浸没在一抗稀释液中，室温条件下摇床孵育1~2 h；取出膜后用TBST液洗膜，之后浸入8‑12mL稀释的碳量子点标记羊毛角蛋白二抗中室温条件下孵育1‑2 h；12）发光显色：直接将免疫处理后的膜在凝胶成像系统中成像，利用碳量子点在紫外光照射下发射荧光的性能，得到免疫印迹图像；如果两样品都得荧光条带，说明古代毛织品残片属于羊毛；如果只有现代羊毛具有荧光条带，说明古代毛织品残片不属于羊毛。