[发明专利]一种利用碳量子点染色的凝胶电泳检测古代毛织品的方法

摘要

本发明涉及文物检测领域，公开了一种利用碳量子点染色的凝胶电泳检测古代毛织品的方法，具体为：取古代毛织品样品，用金属盐法和还原法提取羊毛角蛋白，进行SDS‑PAGE凝胶电泳，用碳量子点溶液进行染色，观察电泳图像。割下条带，进行酶解，采用HPLC‑MS/MS质谱分析，根据质谱检测得到的氨基酸序列与氨基酸序列数据库对比鉴定古代毛织品。这种古代毛织品的检测方法具有提取简单，溶解率和提取效率高，凝胶电泳图像清晰，灵敏、准确度高等优点，非常适合用于年代早、肉眼难以识别、常规方法束手无策的泥化毛织品、矿化毛织品等羊毛古物的鉴定。

主权项

1.一种利用碳量子点染色的凝胶电泳检测古代毛织品的方法，其特征在于，以g和mL计，包括如下步骤：1）向15‑30 mL正庚烷中加入摩尔比为18‑22:1的水和十二烷基苯磺酸钠，制得油相溶液；2）向步骤1）所得油相溶液中，加入质量分数为45‑55%的生物质焦油水溶液，再加入摩尔比为1.8‑2.2:1的正丙醇和十二烷基苯磺酸钠，用力摇晃，溶液变淡黄色，得到反相微乳液，于室温静置10‑13h；3）向步骤2）所得反相微乳液中加入0.2‑0.4 g十二胺，室温下超声8‑12 min；然后向含聚四氟乙烯内胆的反应釜内倒入超声后的混合溶液， 在110‑130℃马弗炉中放置2‑4 h，取出，自然冷却至室温；用无水甲醇破乳，洗涤数次，离心，制得碳量子点原始溶液；4）用酒石酸将0.03‑0.06 mol/L的酒石酸钠溶液的pH调为2.5‑2.8，将此溶液与350‑450μl步骤3）所得碳量子点原始溶液混合均匀，制得碳量子点染胶溶液；5）称取古代毛织品样品，用去离子水反复清洗，去除表面污渍，放入30‑35℃真空烘箱烘干；6）将步骤5）洗净烘干的样品，加入pH =1.5‑2.5的HBr溶液，静置1‑2h，用去离子水搓洗至中性，30‑35℃真空烘干；7）将步骤6）烘干的样品，以1：15‑25的浴比加入含有0.05‑0.15mol/L的LiBr和0.02‑0.04mol/L的十二烷基硫酸钠的溶液中浸没，调节pH值到8‑11，室温下以190‑210W的功率超声30‑50min后，放入微波反应器辐射水解6‑8min；8）从反应器中取出，倒入三口烧瓶，将三口烧瓶置于恒温水浴锅中，调节水浴温度70‑90℃，通氮气10‑20分钟，排除氧气，缓缓加入10‑25ml的2.5‑3.5 mol/L 三(2‑羧乙基)膦溶液，通氮气搅拌，使羊毛溶解，真空抽滤，去除未溶羊毛及杂质；9）加入20‑35g硫酸铵，搅拌均匀，调节滤液pH，离心8‑15min，将下层溶液在2‑6℃条件下用透析袋透析，前9‑12h，每隔1‑2h换一次水，第12‑ 24h每隔2‑5h换一次水，第24‑48h每隔5‑10h换一次水，第48‑72h，每隔10‑15h换一次水，除去表面活性剂、金属盐等杂质；低温真空浓缩至原体积的1/4‑1/2，得到羊毛角蛋白提取液；10)组装制胶器，灌注分离胶，加入纯化水，待分离胶的胶面与水形成可见的界面时，轻轻倒出纯化水，擦干纯化水后插上梳子，注入浓缩胶；待浓缩胶完全聚合后，将梳子轻轻拔出；11)取羊毛角蛋白提取液于2*样品缓冲液按1∶0.8‑1.2比例混合，水浴加热于93‑97℃下加热1.5‑2.5 min，使蛋白质变性并确保结合最大量的十二烷基硫酸钠；样品冷却至室温后，取羊毛角蛋白提取液10‑20μl加入凝胶点样孔， 进行SDS‑PAGE凝胶电泳；12)电泳完毕后，切断电源，取出凝胶，浸入步骤4）所得碳量子点染胶溶液，以低速在摇床上振荡2.5‑3.5h，放到凝胶成像仪中，观察样品的电泳图像；13)将经步骤12)所得染色样品的蛋白质条带割下并装入1.0‑2.0ml离心管中，加入300‑400ul去离子水振荡洗涤，吸出液体，重复一次，加入含10‑30％甲醇、4‑8%甘油、8‑12％乙酸的脱色液40‑70ul，静置2‑4min，用去离子水终止反应并重复洗涤一次，吸出多余的液体；加入180‑220ul 35‑45mmol/L碳酸氢铵溶液振荡洗涤2‑4min，重复一次；加入110‑160 ul乙腈振荡，待胶块变白，吸弃乙腈，置于真空浓缩仪中干燥8‑12min；14)向步骤13)所得的离心管中加入50‑80ul的胰蛋白酶溶液，完全盖住胶粒冰浴40‑50min，使胶粒吸收酶解液溶胀，然后在35‑40℃烘箱中孵育13‑15h进行酶解；15)采用HPLC‑MS/MS对其进行质谱分析，根据质谱检测得到的氨基酸序列与氨基酸序列数据库对比得到古代毛织品是否属于羊毛的结论。