[发明专利]通过过表达spo0A基因提高抗真菌肽bacillomycin D产量的方法

摘要

本发明涉及通过过表达spo0A基因提高抗真菌肽bacillomycin D产量的方法，属于生物技术领域。本方法首先以CGMCC No.0943枯草芽孢杆菌fmbJ为出发菌株，以大肠杆菌‑枯草芽孢杆菌穿梭克隆载体pCBS为骨架构建一个基因过表达载体pCBS‑LPSpo0AR，利用同源重组原理，通过双交换过程在淀粉酶位点敲入枯草芽孢杆菌fmbJ基因组Spo0A基因的方法构建了一个高产bacillomycin D菌株fmbJspo0A。经过高效液相色谱分析，确定改良菌株产bacillomycin D的能力提高1.82倍。

主权项

1.通过过表达spo0A基因提高抗真菌肽bacillomycin D产量的方法，其特征在于：(1)spo0A基因过表达载体pCBS‑LPSpo0AR的构建设计引物Spo0A‑F和Spo0A‑R，以CGMCC No.0943枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)fmbJ基因组DNA为模板PCR扩增带有酶切位点KpnI和BglII的完整的spo0A基因片段813bp；设计引物PamyJ‑F和PamyJ‑R，以枯草芽孢杆菌fmbJ基因组DNA为模板PCR扩增带有SalI和KpnI酶切位点的完整fmbJ淀粉酶启动子基因片段349bp；设计引物L‑amy‑F和L‑amy‑R，以枯草芽孢杆菌fmbJ基因组DNA为模板PCR扩增带有SalI和BglII酶切位点的部分fmbJ淀粉酶基因片段1012bp；扩增得到的三个基因片段分别克隆至pMD19‑T载体，转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5a，经酶切验证、测序正确后，分别命名为pSpo0A‑T、pPamyJ‑T、pLamy‑T，于‑20℃条件下保存备用；pSpo0A‑T用KpnI和BglII双酶切后获得spo0A片段，与经过相同双酶切处理的pMAD载体，用T4 DNA连接酶连接，构建pCBS‑Spo0A载体，酶切验证正确后于‑20℃条件下保存备用；pPamyJ‑T用SalI和KpnI双酶切后获得PamyJ片段，与经过相同双酶切处理的pCBS‑Spo0A载体，用T4 DNA连接酶连接，构建pCBS‑PSpo0A载体，酶切验证正确后于‑20℃条件下保存备用；pLamy‑T用SalI和BglII双酶切后获得Lamy片段，与经过SalI和BamHI双酶切处理的pCBS‑PSpo0A载体，利用BglII和BamHI为同尾酶的原因，消除载体上的BamHI酶切位点，用T4 DNA连接酶连接，构建pCBS‑LPSpo0A载体，酶切验证正确后于‑20℃条件下保存备用；设计同源重组引物R‑amy‑F和R‑amy‑R，以枯草芽孢杆菌fmbJ基因组DNA为模板PCR扩增带有BglII酶切位点的部分fmbJ淀粉酶基因片段952bp以及pCBS‑LPSpo0A载体的部分片段30bp，与经过BglII酶切处理的pCBS‑LPSpo0A载体，用同源重组酶连接，构建pCBS‑LPSpo0AR载体，酶切验证正确后，转化大肠杆菌JM110，用于进一步的电转化；(2)spo0A基因过表达菌株的构建以枯草芽孢杆菌fmbJ制备感受态细胞，采用电转化方法，将获得的spo0A基因过表达载体pCBS‑LPSpo0AR转化入枯草芽孢杆菌fmbJ，在基因组淀粉酶位点发生双交换，在红霉素抗性的LB平板上不长，但在无抗性的LB平板能够生长，且PCR验证出现PamyJ+spo0A的基因片段，此时获得的菌株即为过表达spo0A的菌株，命名为fmbJspo0A；该菌株既包括的原本基因组上的spo0A基因，且在淀粉酶位点处插入了同样的spo0A基因，成为过表达spo0A基因的突变菌株，即为所得到的提高抗真菌肽bacillomycin D产量的菌株。