[发明专利]通过过表达degU基因提高抗真菌肽bacillomycin D产量的方法

摘要

本发明通过过表达degU基因提高抗真菌肽bacillomycin D产量的方法，属于生物技术领域。本方法首先以CGMCC No.0943枯草芽孢杆菌fmbJ为出发菌株，以大肠杆菌‑枯草芽孢杆菌穿梭克隆载体pCBS为骨架构建一个基因过表达载体pCBS‑LPDegUR，利用同源重组原理，通过双交换过程在淀粉酶位点敲入枯草芽孢杆菌fmbJ基因组DegU基因的方法构建了一株高产bacillomycin D菌株fmbJdegU。经过高效液相色谱分析，确定过表达DegU基因的菌株产bacillomycin D的能力大幅度提高。

主权项

1.通过过表达degU基因提高抗真菌肽bacillomycin D产量的方法，其特征在于：(1)degU基因过表达载体pCBS‑LPDegUR的构建设计引物DegU‑F和DegU‑R，以CGMCC No.0943枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)fmbJ基因组DNA为模板PCR扩增带有酶切位点KpnI和NcoI的完整的degU基因片段702bp；设计引物PamyJ‑F和PamyJ‑R，以枯草芽孢杆菌fmbJ基因组DNA为模板PCR扩增带有SalI和KpnI酶切位点的完整fmbJ淀粉酶启动子基因片段349bp；设计引物L‑amy‑F和L‑amy‑R，以枯草芽孢杆菌fmbJ基因组DNA为模板PCR扩增带有SalI和BglII酶切位点的部分fmbJ淀粉酶基因片段1012bp；扩增得到的三个基因片段分别克隆至pMD19‑T载体，转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5a，经酶切验证、测序正确后，分别命名为pDegU‑T、pPamyJ‑T、pLamy‑T，于‑20℃条件下保存备用；pDegU‑T用KpnI和NcoI双酶切后获得degU片段，与经过相同双酶切处理的pMAD载体，用T4DNA连接酶连接，构建pCBS‑DegU载体，酶切验证正确后于‑20℃条件下保存备用；pPamyJ‑T用SalI和KpnI双酶切后获得PamyJ片段，与经过相同双酶切处理的pCBS‑DegU载体，用T4DNA连接酶连接，构建pCBS‑PDegU载体，酶切验证正确后于‑20℃条件下保存备用；pLamy‑T用SalI和BglII双酶切后获得Lamy片段，与经过SalI和BamHI双酶切处理的pCBS‑PDegU载体，利用BglII和BamHI为同尾酶的原因，消除载体上的BamHI酶切位点，用T4DNA连接酶连接，构建pCBS‑LPDegU载体，酶切验证正确后于‑20℃条件下保存备用；设计同源重组引物R‑amy‑F和R‑amy‑R，以枯草芽孢杆菌fmbJ基因组DNA为模板PCR扩增带有BglII和NcoI酶切位点的部分fmbJ淀粉酶基因片段952bp以及pCBS‑LPDegU载体的部分片段30bp，与经过BglII和NcoI双酶切处理的pCBS‑LPDegU载体，用同源重组酶连接，构建pCBS‑LPDegUR载体，酶切验证正确后，转化大肠杆菌JM110，用于进一步的电转化；(2)degU基因过表达菌株的获得以枯草芽孢杆菌fmbJ制备感受态细胞，采用电转化方法，将获得的degU基因过表达载体pCBS‑LPDegUR转化入枯草芽孢杆菌fmbJ，在基因组淀粉酶位点发生双交换，在红霉素抗性的LB平板上不长，但在无抗性的LB平板能够生长，且PCR验证出现PamyJ+degU的基因片段，此时获得的菌株即为过表达degU的菌株，命名为fmbJdegU，该菌株既包括的原本基因组上的degU基因，且在淀粉酶位点处插入了同样的degU基因，成为过表达degU基因的突变菌株，即为所得到的菌株。