[发明专利]一种猴头杜鹃菌根真菌菌株DPS-A的分离纯化及其接种应用方法

摘要

本发明公开了一种猴头杜鹃菌根真菌菌株DPS‑A的分离纯化及其接种应用方法，包括以下步骤：（1）选菌根与称量；（2）根系表面灭菌；（3）检验灭菌效果；（4）根系组织匀浆；（5）菌株纯化；（6）菌株初步筛选；（7）菌剂制备；（8）菌株接种；（9）接种效应检测。优点有：菌株分离与纯化周期较短，技术操作简便，实现了猴头杜鹃菌根真菌分离与纯化的高效率与大规模操作。

主权项

1.一种猴头杜鹃菌根真菌菌株DPS‑A的分离纯化及其接种应用方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）选菌根与称量：将猴头杜鹃健壮的根系在清水中洗净泥土杂质，用滤纸吸干水分，剪去直径大于1 mm的粗根，保留直径在1 mm以下的纤细根系，称取0.05 g根系，切碎成0.3cm ~ 0.4 cm的碎根段，作为根系样品备用；（2）根系表面灭菌：在超净工作台内将备好的根系样品用75%乙醇水浸泡15 s，无菌水漂洗3次~ 5次，再在10%的家用84消毒液中浸泡15 min，无菌水漂洗3次~ 5次；（3）检验灭菌效果：用玻璃涂布器蘸取少量最后一遍漂洗根系样品的无菌水，均匀涂抹于马丁‑孟加拉红培养基平板，作为对照组检验灭菌效果、排除杂菌；（4）根系组织匀浆：将根系样品放入玻璃匀浆器，加入5 ml无菌水，上下转动研磨30次~ 40次，使根系组织匀浆化，分别用移液枪取根系组织匀浆液1 ml置入5 ml、10 ml、20 ml、50 ml、100 ml烧杯中，添加无菌水稀释到1/5、1/10、1/20、1/50、1/100浓度，分别用移液枪取0.5 ml不同浓度的稀释液置于马丁‑孟加拉红培养基平板的表面，用玻璃涂布器涂抹均匀，然后与对照组平板一起放置在25 ℃培养箱中暗培养；（5）菌株纯化：培养3天~ 5天，待菌落从平板中长出，在超净工作台内用牙签挑取少量菌丝至麦芽浸膏琼脂培养基平板上，培养7天后观察菌落形态的一致性和均匀性，若菌落形态有差异，则进行二次分离，如此反复直至纯化；（6）菌株初步筛选：把纯化后的菌株根据菌落形态特征进行描述记录和分类整理，指标包括菌落颜色、质地、边缘形状、直径、是否有液体分泌物等，初步剔除生长过快、明显不是杜鹃花科植物菌根真菌的菌株，其中，25℃暗培养两周后，菌落正面颜色为浅黄色、背面颜色为黄色，质地绒毡状，边缘形状不规则，菌株直径3.8 cm ~ 4.2 cm，无液体分泌物的菌株为菌株DPS‑A；（7）菌剂制备：在超净工作台内，用牙签挑取少量猴头杜鹃菌根真菌DPS‑A的菌丝至麦芽浸膏琼脂培养基平板上，放置在25 ℃培养箱中黑暗培养2 ~ 3周后，选取菌落生长范围内、长满菌丝的培养基作为接种菌剂；（8）菌株接种：将拟接种的蓝莓组培苗在超净工作台内移栽到菌株接种基质内，每瓶接种1株苗木，用脱脂棉将瓶身内壁擦净，将接种菌剂切成5 mm × 5 mm的方形菌丝块，浅埋在接种蓝莓周围1.5cm~ 2.0cm距离的基质表层，每瓶接种3个菌丝块，将没有菌丝生长的麦芽浸膏琼脂培养基切成同等大小的方块，浅埋在接种蓝莓周围1.5cm ~ 2.0cm距离的基质表层，每瓶接种3个培养基方块，作为对照组，将苗木置于25 ℃、光照周期10 h ~14 h，光照强度3000 lux的培养室进行培养；（9）接种效应检测：培养60 天后，观察菌株接种组与未接种菌株组蓝莓的生长态势，检测并统计蓝莓的菌根侵染率、叶片增加数、高度增长率、鲜重增重率、干重增重率。