[发明专利]一种KRAS基因突变检测的新方法

摘要

一种连接介导的环介导等温扩增对KRAS基因突变检测的新方法；包括以下步骤：(1)连接反应制备哑铃状模版：向连接酶的缓冲液加入连接探针，连接酶，KRAS突变序列后放入PCR仪进行连接，反应得到哑铃状模版；(2)将步骤(1)所得哑铃状模版与环介导等温扩增体系变性后加入染料及Bst酶混匀并置于实时荧光荧光PCR仪中反应，引物识别哑铃状模版并触发环介导等温扩增，实时监测荧光信号。本发明成功构建了用于监测实际样本中KRAS突变的荧光分析法，用本方法对KRAS突变样本中提取的基因组DNA进行检测，具有灵敏度高，特异性强，抗干扰能力强等特点。

主权项

1.一种KRAS基因突变检测的新方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)连接反应制备哑铃状模版DSS：向连接酶的缓冲液中加入连接探针SLS1、连接探针SLS2、连接酶、KRAS突变序列MutDNA，混匀后放入PCR仪中95℃预变性3分钟，63℃反应1分钟，95℃反应30秒，30个连接循环反应后得到哑铃状模版；(2)将步骤(1)所得哑铃状模版与环介导等温扩增体系混匀并置于实时荧光定量PCR仪中，使得引物识别并触发环介导等温扩增，实时监测荧光信号；即设计两条茎环状的连接探针用于靶序列的识别，其中一条连接探针5’端修饰磷酸基团，另一条连接探针3’端修饰羟基，将连接探针，靶序列，Taq DNA连接酶及连接酶缓冲液混匀置于PCR仪中进行连接反应，靶序列作为连接模版与连接探针互补配对；在Taq DNA连接酶的作用下，将连接探针连接起来形成哑铃状模版，然后取连接产物加入环介导等温扩增体系，包括两条引物及缓冲液，dNTP，混匀后95℃变性3分钟后置于冰上，加入荧光染料SYBR Green I和Bst DNA聚合酶置于实时荧光定量PCR仪中65℃反应1小时，引物FIP可与哑铃状模版的环状部分杂交，在Bst DNA聚合酶的链置换活性和聚合酶活性下进行环介导等温扩增，产生大量的DNA双链，荧光染料SYBR Green I可特异地结合地结合到DNA双链上，产生可检测的荧光信号，由实时荧光定量PCR仪分析检测。