[发明专利]一种原代间充质干细胞的提取、培养和传代培养方法

摘要

本发明公开了一种原代间充质干细胞的提取、培养和传代培养方法，其中主要包括：在原代培养时，延长首次换液的时间到72h，采用完全换液方法，之后每2～3天完全换液一次，保证原代大鼠骨髓间充质干细胞的营养支持；培养至第7～10天镜下可见大量的集落形成，根据集落细胞的长势来决定首次传代的时间，不必等到细胞融合度达到80～90％再传代；在原代间充质干细胞传代培养的过程中，降低胰酶消化液的浓度，减少胰酶消化液用量，缩短胰酶消化接触时间。本发明在保证原代细胞分离培养纯度的条件下，简化了原代细胞分离培养方法，缩短了原代培养时间，通过调整胰酶消化浓度、用量、时间，最大程度地保留了细胞生长活力。

主权项

1.一种原代间充质干细胞的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)取SPF级3～4周龄的雄性SD大鼠拉颈处死后，用75％乙醇浸泡5min；(2)快速分离乙醇浸泡后大鼠的双侧股骨及胫骨，在含有预冷的PBS缓冲液的培养皿中去除股骨和胫骨周围的肌肉组织和结缔组织，剪去包括骺板在内的两侧骺端和软骨组织，并用预冷的PBS缓冲液反复冲洗分离下来的股骨和胫骨；(3)用注射器抽取15ml预冷的含10％FBS和1％双抗的DMEM/F12完全培养基冲洗步骤(2)所得大鼠的骨髓腔，反复冲洗3～4遍直至骨髓腔发白；(4)用1ml枪头反复吹打步骤(3)获得的骨髓冲洗液，制成单细胞悬液，室温静置至大块组织和骨骼碎片沉降到离心管底部后，轻轻吸取全骨髓细胞悬液接种于培养瓶中，放到37℃浓度为5％CO2细胞培养箱中静置培养，至少72h后首次完全换液，去除未贴壁细胞，得到的贴壁细胞中含有所述原代间充质干细胞。