[发明专利]一种适用于PacBio测序平台的扩增子混样测序文库构建方法

摘要

本发明涉及一种适用于PacBio测序平台的扩增子混样测序文库构建方法，针对现有PacBio核酸测序平台应用于扩增子扩增的文库构建中，存在试剂成本高、步骤复杂等技术问题，该方法基于扩增子样本的扩增原理，结合PacBio测序技术特征，针对每个待测样本在第一步扩增中引入反向互补的标签序列，使同一次扩增的扩增子都标记有标签序列，将带有不同标签的扩增子混合，标签序列在后续文库构建中一直保留，因此该方法可实现多个扩增子样品仅需一次文库构建，简化了实验操作流程，提高了建库效率，降低了测序成本。本发明在设计标签序列时，使每种样本的两个引物5’端添加的标签序列反向互补，测序时两端均可识别出标签序列，极大提高扩增子样本的标签序列识别效率。

主权项

1.一种适用于PacBio测序平台的扩增子混样测序文库构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)设计与合成带标签的扩增引物：每个待测样本设计并合成一对扩增子的扩增引物，其中每对引物的5’端带有标签序列，每对引物的5’端标签序列反向互补且唯一无重复；每对引物的3’端为扩增子的特异性引物；(2)扩增子样本的扩增：分别以各个样本DNA为模板、以对应的带标签的扩增引物为引物进行PCR扩增，扩增之后纯化PCR产物并确定片段的大小分布；(3)将每个样本的DNA扩增纯化产物等摩尔量混样，混样后总量大于2μg；(4)将混样扩增产物进行末端修复并纯化；(5)对步骤(4)中的纯化产物与平末端接头进行连接反应；(6)对步骤(5)获得的连接产物进行外切酶消化和纯化，得到适用于PacBio测序平台的扩增子混样测序文库。