[发明专利]一种高通量检测多种靶基因的方法

摘要

本发明提供了一种高通量检测多种靶基因的方法以及试剂盒，属于PCR基因检测技术领域，包括以下步骤：设计荧光标记探针；筛选两两之间熔解温度不同的荧光标记探针的同源突变序列作为标签序列组；将所述标签序列组中的标签序列与靶基因特异性引物其中一条连接，获得靶基因带标签的特异性引物；将待检DNA样品、荧光标记探针、不同靶基因带标签和不带标签的特异性引物混合于PCR反应体系中进行混合基因体系PCR扩增反应后，收集熔解曲线的荧光信号，与确定的靶基因的熔解温度Tm值进行比较，若相同，则说明待检DNA样品中存在相应靶基因。所述方法能够高通量检测多种靶基因，时间短，成本低。

主权项

1.一种非疾病诊断和治疗目的的高通量检测多种靶基因的方法，包括以下步骤：1)设计随机探针序列，并对随机探针序列进行荧光标记获得荧光标记探针；2)将所述探针序列的反向互补序列进行随机突变，获得探针序列的反向互补序列的突变序列组，将所述突变序列组中的序列与探针序列互补结合获得双链DNA组，筛选所述双链DNA组中两两双链DNA之间具有熔解温度差的双链DNA，突变序列组中的相应序列为反向标签序列组，合成所述反向标签序列组的互补序列为标签序列组；3)设计靶基因的特异性引物对，所述特异性引物对包括特异性上游引物和特异性下游引物；将所述标签序列组中的一条标签序列与所述特异性引物对中的一条连接，获得带标签序列的特异性引物；4)将包含步骤3)中所述靶基因的DNA片段、荧光标记探针、所述带标签序列和不带标签的特异性引物、dNTPs、DNA聚合酶、PCR反应缓冲液混合进行单基因体系PCR扩增反应后，进行熔解曲线分析，获得靶基因的熔解温度Tm值，作为所述靶基因的标准Tm值；5)按照步骤3)～4)的方法操作得到多个不同靶基因的标准Tm值，分别为Tm₁、Tm₂、Tm₃……Tm_n；不同靶基因的特异性引物连接步骤2)中所述标签序列组中的不同的标签序列；6)将待检DNA样品、荧光标记探针、各靶基因的带标签和不带标签的特异性引物、dNTPs、DNA聚合酶、MgCl、PCR反应缓冲液混合进行混合基因体系PCR扩增反应后，进行熔解曲线分析，将所述熔解曲线中的波谷或波峰对应的温度值与步骤5)中各靶基因的标准Tm值进行比较，若熔解曲线中的波谷或波峰对应的温度值与步骤5)中靶基因的标准Tm值相同，则说明待检DNA样品中存在产生所述标准Tm值的靶基因；所述荧光标记探针的序列为一种或多种；当所述荧光标记探针的序列为多种时，各种荧光标记探针上标记不同的荧光基团；当所述荧光标记探针的序列为多种时，步骤6)中所述混合基因体系PCR扩增反应后，通过不同的荧光通道收集标记不同荧光基团的荧光标记探针熔解曲线的荧光信号。