[发明专利]一种利用发根农杆菌诱导蒲公英产生毛状根的方法

摘要

本发明公开了一种利用发根农杆菌诱导蒲公英产生毛状根的方法，该方法包括如下步骤：外植体的制备、发根农杆菌的活化、发根农杆菌浸染及共培养、毛状根除菌和继代培养。本发明经过继代培养最终成功诱导蒲公英产生毛状根，其具有更强的产生次生代谢产物的潜能。采用本发明进行毛状根诱导所获得的毛状根具有生长速度快、遗传稳定性好的优点。本发明不仅操作简单、便捷，而且诱导率高，具有大规模生产工业用蒲公英药用成分的替代资源的潜力。

主权项

1.一种利用发根农杆菌诱导蒲公英产生毛状根的方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：步骤一、外植体的制备蒲公英种子用温水浸泡，选取饱满的蒲公英种子置于容器中，经消毒、冲洗并用无菌纸吸干种子表面残留水分后，将蒲公英种子转接到1/2MS固体培养基上，于温度21℃～23℃、光周期为8h～16h的人工气候箱培养30～35d，待无菌苗长至一定高度时，采取蒲公英外植体进行侵染实验；步骤二、发根农杆菌的活化将低温保存的发根农杆菌R1601取出，接种菌液于LB固体培养基内，在25℃～30℃的条件下培养2～3d长出单菌落后，在无菌操作的前提下挑取单菌落，并将其转入含LB液体培养基的离心管中，于温度为25℃～30℃、转速为150～200r/min的摇床培养18～20h，培养至菌液变浑浊，然后将菌液和LB液体培养基按体积比1:1的比例转入新的离心管中，于温度为25℃～30℃、转速为150～200r/min的条件下进行二次活化；待培养18～20h至菌液变浑浊后，吸取活化过两次的菌液并按照菌液：LB液体培养基＝1:100的比例进行温度为25℃～30℃、转速为150～200r/min的摇床扩大培养，直至测定菌液OD600达到0.5～0.8，用低速冷冻离心机以3000r/min的条件下离心20min，并用MS液体培养基洗涤2～3次，分别重悬至OD600＝0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0，所得菌悬液备用；步骤三、发根农杆菌浸染及共培养(1)外植体的预培养用剪刀将由步骤一获得的蒲公英无菌苗的叶片根切断后用无菌镊子取出，放置在提前灭过菌的含有无菌吸水纸的平皿中；然后用剪刀或无菌手术刀将叶片的边缘剪出伤口，并将其剪成0.4～0.6cm2的小块，将根剪成0.8～1.2cm长；最后将处理过的外植体接种在含有100μmol/L乙酰丁香酮的MS固体培养基上培养1～3d，完成外植体的预培养阶段；(2)菌液共培养取出预培养后的外植体，放置于经步骤二活化的菌液中，期间不停震荡，浸染2～15min，后将浸染后的外植体取出，并用吸水纸吸干表面残余的菌液，接种到含有100μmol/L乙酰丁香酮的MS固体培养基上置于人工气候箱中培养1～3d；(3)除菌培养在无菌条件下，将完成共培养的外植体转移至含有100～300mg/L头孢噻肟钠的1/2MS固体培养基中于人工气候箱中培养，每隔3～5d转接一次，并将头孢噻肟钠的浓度降低，且每次转接时用无菌水冲洗外植体5～10次，并用吸水纸吸干表面残存的水分，直至培养到在不含头孢噻肟钠的培养基中培养，且没有菌落生成；步骤四、毛状根除菌在步骤三除菌培养中的外植体毛状根长至3～5cm，剪取毛状根，置于含有100～300mg/L头孢噻肟钠的1/2MS固体培养基中进行继代培养，直至完全除去农杆菌；步骤五、继代培养将步骤四除菌后的根放于含有1/2MS液体培养基上进行转代培养，黑暗中，24℃～26℃培养，即完成本发明所述的利用发根农杆菌诱导蒲公英产生毛状根。