[发明专利]人类肺干细胞的分选方法

摘要

本发明涉及一种肺组织干细胞的分选方法，尤其是一种人类肺干细胞的分选方法。包括处理肺组织，抗体孵育以及流式分选等步骤，利用该方法分选人类肺干细胞可以直接对人类肺干细胞进行研究，首次解决了阻碍人类干细胞研究的难题。

主权项

1.一种人类肺干细胞的分选方法,其特征在于，包括下述步骤：1)将肺组织剪成1cm³小块,使用HBSS清洗后，转移至有盖培养皿机械剁碎成肺靡，并转移至50ml离心管中；2)将37℃Liberase TM加入到步骤1)得到的离心管中；添加比例为：每1cm³的肺组织添加10mL的Liberase TM工作液；3)将步骤2)得到的离心管，放入混匀仪中，1000rpm，37℃，摇动45min；取出，移液管上下吹打至大块的组织分离开，继续放入混匀仪，1000rpm，37℃，摇动15min；确保制成单细胞悬浮液；4)再次用10ml移液器上下吹打，利用多选择性细胞过滤器，过滤肺组织消化液；滤去胞外基质；5)用50ml含有2％FBS的HBSS重悬步骤4)得到的肺组织消化液，4℃，400g，离心5分钟；倾倒或吸出上清液，用含有2％FBS的HBSS多次重悬肺组织细胞团；6)倾倒或吸出上清液，用2‑5mL红细胞裂解液重悬细胞团，在冰上孵育2分钟，期间温和振荡得到裂解液；7)立即添加20mL含有2％FBS的HBSS，稀释裂解液；4℃，400g，离心5分钟，弃去上清，用移液管吸取1mL含有2％FBS的HBSS重悬细胞团，然后添加9mL含2％FBS的HBSS，总体积为10mL；8)用70μM的过滤网，将细胞过滤到50mL离心管中，以滤掉红细胞膜；4℃，400g，离心5分钟，用含有2％FBS的HBSS重悬细胞；细胞计数；9)抗体孵育；一抗7AAD PE‑Cy5，Anti‑Human CD326(EpCAM)PE‑Cyanine7，Anti‑CD271(NGF Receptor)PE，anti‑human HTII孵育45分钟；二抗Anti‑Human CD31(PECAM‑1)Biotin，anti‑human CD45 Biotin，孵育40分钟；10)流式分选；排除7AAD阳性细胞，CD31阳性细胞，CD45阳性细胞；选择EpCAM阳性，HTII阳性，NGFR阴性为肺泡Ⅱ型细胞；选择EpCAM阳性，HTII阴性，NGFR阴性为Club细胞；选择选择EpCAM阳性，HTII阴性，NGFR阳性为基底细胞。