[发明专利]导致糟辣椒生花微生物的分离和鉴定方法

摘要

一种导致糟辣椒生花微生物的分离和鉴定方法，属于微生物技术领域，经过对“生花”糟辣椒中微生物的分离，得到了2株主要“生花”菌。将其反接于灭菌糟辣椒后，其中从PDA培养基中分离的菌株能导致“生花”现象，通过对分离到的菌株进行ITS序列分析，证实引起糟辣椒“生花”腐败的菌株为库德毕赤酵母(Pichiakudriavzevii)。而从NA培养基中分离的菌株不能导致糟辣椒“生花”，经革兰氏染色镜检后初步判定为革兰氏阳性球菌。

主权项

1.一种导致糟辣椒生花微生物的分离和鉴定方法，其特征在于：包含如下步骤：1）、微生物的分离纯化：挑取生花糟辣椒表面的白色物质于9mL无菌水中，震荡摇匀后进行10倍稀释到10‑3，分别取1ml各个浓度梯度的菌悬液均匀涂布于PDA和NA培养基中，PDA培养基在28℃下有氧培养，培养时间24‑36h；NA培养基在36℃下有氧培养，培养时间36‑48小时；挑取不同菌落形态特征的单菌落进行平板划线，经6次纯化后对菌落进行特征描述，同时挑取单菌落进行厌氧培养，并观察其生长情况，最后放置在4℃冰箱中进行试管斜面保种；2）、染色镜检：用已灼烧灭菌的接种环分别挑取PDA和NA培养基中培养的最后一次纯化的单菌落于滴有一滴无菌水的载玻片上，进行菌体的固定，之后对NA培养基中挑取的菌落进行革兰氏染色，革兰氏染色步骤为结晶紫初染1min、碘液媒染1min、酒精脱色30s、沙黄复染1min；并使用油镜进行观察；对PDA培养基中挑取的菌落用碘液染色1min后用显微镜观察，记录观察结果；3）、反接实验：将纯化后的菌株制成悬液，分别加0ml、1ml、2ml、4ml菌悬液于已灭菌的未添加任何防腐剂的糟辣椒中有氧培养，培养温度为26℃，每天观察糟辣椒是否产生“生花”现象；4）、“生花”微生物的DNA提取：挑选出反接实验中能导致糟辣椒产生“生花”现象的菌株，并使用DNA提取试剂盒进行提取单菌落的总DNA，操作步骤严格按照说明书进行；步骤如下：（1）挑菌放于离心管中，并用移液枪吸取200ul溶液A和20ul RNase A加入其中，再加入50mg玻璃珠，使用漩涡混合仪振荡10min；（2）移取20ul的蛋白酶K(10mg/ml)加入其中,混合均匀后在55℃下水浴30min,12000rpm离心2min；后将上层清液转移到新的离心管中；（3）在上层清液中加入200ul的溶液B,充分混匀后，于55℃下水浴5‑10分钟；（4）移取200uL无水乙醇加入其中并充分混匀，将所有物质全部转移到吸附柱中，12000rpm离心1min，弃废液；（5）加600ul漂洗液于吸附柱中，12000rpm离心1min，过程重复2次；（6）12000rpm离心2 min，将吸附柱放置于新的离心管中，悬空滴加150ul经65℃水浴预热的洗脱液，放置5min后12000rpm离心1min；（7）将离心所得到的洗脱液再次加入至吸附柱中，并12000rpm离心2 min，得到目的DNA；5）、PCR扩增和电泳：真菌扩增使用ITS1、ITS4作为引物，ITS1:5'‑TCCGTAGGTGAACCTGCGG‑3'，ITS4:5'‑TCCTCCGCTTATT‑GATATGC‑3'；PCR扩增体系为20μl，包括ddH2O14ul，10 X PCR Buffer(with Mg2+) 2ul，dNTP(2.5Mm each) 1.6ul，模板DNA 0.7ul，上游引物与下游引物各0.8ul，Taq DNA polymerase(5U/ul) 0.1ul；PCR反应参数：94℃预变性3min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环，72℃最终延伸10min，4℃保存；量取20ml 0.5倍的TBE溶液，加入0.2g琼脂糖煮沸，加入2ul核酸染料，制成1%琼脂糖凝胶用于电泳，滴加4ul的100bpDNA Ladder Marker作为参照，滴加4ul混有Loading buffer 的扩增产物，电压：120V，电流：2mA，时间：20‑30min；6）、测序并序列同源性分析：将目的DNA进行测序检测，并把测序结果在GeneBank中通过BLAST进行基因比对后进行菌种的鉴定。