[发明专利]大鼠肝脏巨噬细胞培养方法

摘要

本发明涉及一种大鼠肝脏巨噬细胞培养方法，通过提取培养大鼠肝脏巨噬细胞，建立肝脏巨噬细胞作用模型，对于肝脏巨噬细胞在纤维化、肝炎、肝肥胖疾病和肝移植的研究中有重要作用。

主权项

1.大鼠肝脏巨噬细胞培养法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将100mg VI胶原蛋白酶溶解于100ml Kupffer细胞专用基础培养基中制成0.1%的消化液，40℃水浴锅内预热10min；（2） 将300mg肝素钠溶解于100ml Kupffer细胞专用培养基中制成0.3%的清洗液液，40℃水浴锅内预热10min；（3） 取健康雌性SD大鼠1只，体重200g左右，异氟烷麻醉机麻醉大鼠，碘伏消毒液擦拭大鼠全身皮肤；（4）大鼠呈仰卧位固定，十字型切口打开腹腔，将胃、肠推向大鼠左侧，暴露出肝脏；（5） 在肝门静脉插入留置针并用手术缝合线结扎注留置针软管，快速从下方切段下腔静脉，切段下腔静脉后3S内立刻从留置针灌注80ml清洗液液，灌注流速为12ml/min；（6）灌注期间用无菌棉球堵住下腔静脉切口以便灌注充分，灌注期间没30s更换一次棉球；（7）清洗完成后再灌入50ml消化液，流速为10ml/min，灌注期间每30s更换一次棉球；（8）切取肝脏放置于培养皿内，眼科剪将肝脏剪至1.5mm3大小，转入30ml消化液中，37℃ 190rmp/ml摇动消化18min；（9）70um细胞筛过滤消化好的细胞悬液，100g/min离心3min；（10）取上清于新的50离心管中，400g/min离心8min，弃上清，10ml清洗液重悬细胞；（11）取新的50ml离心管一个，加入10ml 65%的percoll分离液，再往上层加入10ml 35%的percoll分离液，最后将10ml细胞悬液加到最上层；（12） 950g/ml离心20min，用巴氏吸管小心吸取35%、65%percoll分离液交界处白膜层，用10ml清洗液重悬细胞，400g/min离心8min收集细胞，弃上清；（13） 用2ml Kupffer专用完全培养基重悬细胞，计数，调整浓度至105个细胞/ml，接种5ml细胞悬液至100ug/ml多聚赖氨酸（15‑30万单位）过夜包被过的T25瓶内，37℃、5%CO2培养箱内培养；（14）接种2.5h后弃去培养基，专用完全培养基轻轻清洗已贴壁细胞3次，再加入5ml完全培养基后继续培养。