[发明专利]一种对RNA分子进行绝对定量的高通量测序方法

摘要

本发明提供了一种对RNA分子进行绝对定量的高通量测序方法：RNA样品脱磷酸化；再通过T4 RNA连接酶，连接脱磷酸化的RNA与DNA接头1，捕捉95%以上的RNA；之后用去甲基化酶减少RNA修饰；再去除多余的接头1；然后以上述RNA为模板逆转录得到cDNA；再降解RNA模板；通过T4 DNA连接酶连接cDNA与发卡结构的DNA接头2，连接98%以上cDNA；再去除多余的接头2；最后进行PCR引物扩增并测序。本发明通过特殊设计DNA接头，克服了现有RNA测序技术中连接效率偏好性导致的无法精确定量，以及无法捕捉含有修饰位点的RNA分子的缺陷，实现了能够实现对不同来源的RNA样品中所有RNA分子进行绝对定量。本发明的方法简便，可用于临床分子诊断、分子生物学研究、细菌抗药性、癌症发生及预防等领域。

主权项

1.一种对RNA分子进行绝对定量的高通量测序方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）RNA样品脱磷酸化；（2）通过T4 RNA连接酶连接步骤（1）获得的RNA与特殊设计的DNA接头1；（3）利用去甲基化酶减少RNA修饰；（4）去除多余的DNA接头1；（5）以步骤（4）中的RNA为模板逆转录得到cDNA；（6）降解RNA模板；（7）通过T4 DNA连接酶连接步骤（6）获得的cDNA与特殊设计的DNA接头2；（8）去除多余的DNA接头2；（9）利用NGS测序进行标准PCR引物扩增并测序；所述DNA接头1的序列如SEQ No. 1所示，其3’端碱基为双脱氧核苷酸；DNA接头2的序列如SEQ No. 2所示，其5’端磷硫酰化修饰，其3’端修饰丙烷；逆转录的引物序列如SEQ No. 3所示，5’端含有6个磷硫酰化修饰；步骤（2）中，RNA样品中还包括不同系列浓度的内参RNA；步骤（7）中，DNA接头2为发卡结构，通过热变性后缓慢降温获得；所述步骤（1）中，RNA为tRNA。