[发明专利]一种嵌合抗原受体γδT细胞的制备方法

摘要

本发明涉及一种嵌合抗原受体γδT细胞的制备方法，首先制备PBMCs，然后在体外对γδT细胞进行扩增，接着加入CAR病毒和polybrene进行感染，本发明方法中根据γδT细胞纯度，来确定制备CAR‑γδT细胞时间，不需要额外进行细胞纯化，简化了操作流程，降低了成本，本发明方法操作简单、成本低，制备的CAR‑γδT细胞具有特异性肿瘤杀伤作用，并可产业化生产。

主权项

1.一种嵌合抗原受体γδT细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)取外周血，肝素抗凝，采用淋巴细胞分离液分离，得到PBMCs；(2)向无血清培养基加入5‑10v％的自体血浆，然后加入唑来膦酸、IL‑2和IL‑15，得到γδT细胞刺激培养基，使用γδT细胞刺激培养基悬起PBMCs，并调整密度至2‑4×106个细胞/mL，接种于培养瓶中，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养；(3)待步骤(2)中培养至第3d时，离心去除刺激培养基，使用γδT细胞扩增培养基将细胞密度调整到2‑4×106个细胞/mL，以后每2‑3d根据细胞密度补充扩增培养基，使细胞密度维持在2‑4×106个细胞/mL，每天检测γδT细胞纯度，当γδT细胞纯度大于80％时，即可收获γδT细胞；所述γδT细胞扩增培养基的制备方法：向无血清培养基中加入IL‑2和IL‑15，混匀即得；(4)将步骤(3)得到的γδT细胞用γδT细胞扩增培养基将细胞密度调至3‑10×106个细胞/mL，然后加入CAR病毒和polybrene进行感染，并置于37℃、5％CO2的培养箱中培养；(5)待步骤(4)中感染3‑8h后，去除培养基以去除病毒，得到改造后的γδT细胞，加入γδT细胞扩增培养基继续培养，每2‑3d补加γδT细胞扩增培养基使细胞密度维持在2‑4×106个细胞/mL，每天检测改造后的γδT细胞比例，当比例大于10％时，收集的细胞即为嵌合抗原受体γδT细胞。