[发明专利]一种利用T4脱氧核糖核酸连接酶提高原核微生物诱变育种效率的方法

摘要

本发明公开了一种利用T4脱氧核糖核酸连接酶提高原核微生物诱变育种效率的方法，是通过构建质粒使T4脱氧核糖核酸连接酶在待诱变的原核微生物细胞内异源表达；利用常压室温等离子体诱变技术处理待诱变原核微生物菌株；诱变菌株的处理和培养实现。实验证实在原核微生物大肠杆菌，植物乳杆菌，恶臭假单胞菌中，过量表达T4 DNA Ligase情况下，可以显著提高造成双链断裂诱变处理后宿主菌的存活率，并提高突变效率。提示T4 DNA Ligase在原核微生物诱变育种方面有着应用前景。

主权项

1.一种利用T4脱氧核糖核酸连接酶提高原核微生物诱变育种效率的方法，步骤是：a.通过构建质粒使T4脱氧核糖核酸连接酶在待诱变的原核微生物细胞内异源表达；b.利用常压室温等离子体诱变技术处理待诱变原核微生物菌株；c.诱变菌株的处理和培养；其特征在于：步骤a所述T4脱氧核糖核酸连接酶是来源于肠杆菌噬菌体T4的ATP依赖性的脱氧核糖核酸连接酶；所述使T4脱氧核糖核酸连接酶在待诱变的原核微生物细胞内异源表达的方法是：利用PCR反应扩增T4脱氧核糖核酸连接酶编码基因，克隆到目的原核微生物菌种的表达载体上实现细胞内异源表达，其表达后能够以非同源末端连接的方式修复细胞内的基因组脱氧核糖核酸双链断裂，并在修复处形成随机长度的脱氧核糖核酸碱基缺失；步骤b所述常压室温等离子体诱变技术中涉及的等离子诱变仪的诱变条件及方法是：将处于对数生长期的待诱变菌株用无菌生理盐水洗涤后，再稀释到菌液OD600为1.0，然后滴到载片上，将载片置于等离子诱变仪上气流端口1～2mm处，设置仪器功率为100W，气流量为10SLM，实施照射；步骤c所述诱变菌株的处理和培养的方法是：待等离子诱变仪照射后，立即将载玻片放入1mL的生理盐水中涡旋振荡获得菌体洗涤液，然后涂布于含有壮观霉素的固体培养基平板上，恒温过夜培养，统计平板上的单菌落数，计算菌体存活率。