[发明专利]一种人Epo基因在牛β-casein基因座上定位整合的基因打靶方法有效
| 申请号： | 201811160145.2 | 申请日： | 2018-09-30 |
| 公开（公告）号： | CN109266678B | 公开（公告）日： | 2022-05-17 |
| 发明（设计）人： | 张学明;王雅楠;丁海麦 | 申请（专利权）人： | 张学明 |
| 主分类号： | C12N15/85 | 分类号： | C12N15/85;C12N15/90;C12N5/10;C07K14/505 |
| 代理公司： | 重庆乐泰知识产权代理事务所(普通合伙) 50221 | 代理人： | 付金星 |
| 地址： | 014000 内蒙古*** | 国省代码： | 内蒙古;15 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种CRISPR/Cas9介导的人Epo基因在牛β‑casein基因座上定位整合的基因打靶方法。该方法包括，从人肾脏中提取得总RNA，PCR扩增牛β‑casein基因第二外显子上游1062bp片段及其下游1065bp片段分别被插入到骨架载体neo基因的上游和下游作为打把载体的5'同源臂和3'同源臂，将人EPO cDNA插入到5’同源臂下游，构建以neo基因作为正筛选因子的人EPO cDNA基因在牛β‑casein基因座定位整合的打把载体，基于打靶位点序列，设计并构建特异性断裂靶位点序列的CRISPR/Cas9表达载体，采用电击转染法将打把载体和CRISPR/Cas9表达载体共转染到牛胎儿成纤维细胞中，获得人Epo基因在牛β‑casein基因座上定位整合的基因打靶牛胎儿成纤维细胞。 | ||
| 搜索关键词： | 一种 epo 基因 casein 定位 整合 打靶 方法 | ||
【主权项】：
1.一种人Epo基因在牛β‑casein基因座上定位整合的基因打靶方法，包括以下步骤：1)从人肾脏中提取总RNA，用RT‑PCR法扩增人EPO cDNA基因；2)人Epo基因在牛β‑casein基因座上定位整合的基因打靶载体的构建；3)特异性断裂靶位点序列的CRISPR/Cas9表达载体的构建；4)分离培养牛胎儿的成纤维细胞；5)将步骤2)的打靶载体和步骤3)的CRISPR/Cas9表达载体共转染到牛胎儿成纤维细胞中，获得人Epo基因在牛β‑casein基因座上定位整合的基因打靶牛胎儿成纤维细胞。
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