[发明专利]一种基于代谢组学的辣木籽抗糖尿病的血清潜在标志物代谢通路及研究方法

摘要

本发明公开了一种基于代谢组学的辣木籽抗糖尿病的血清潜在标志物代谢通路及研究方法，涉及一种天然植物药作用机制的研究方法。本发明要解决现有的单一的药理学方法不能系统、全面地评价天然植物药作用机制的问题。通过以下步骤实现：(1)采用核磁共振技术检测分析高糖高脂饮食加小剂量链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠及辣木籽干预后的血清代谢产物；(2)筛选出14个辣木籽抗糖尿病相关血清潜在标志物并进行鉴定；(3)筛选出辣木籽抗糖尿病的5个代谢通路并进行分析。本发明可更全面、高效、快速的从整体水平无偏向性的综合评价辣木籽抗糖尿病作用机制，为天然植物药抗糖尿病作用机制的阐明及进一步开发提供依据。

主权项

1.一种基于代谢组学的辣木籽抗糖尿病的血清潜在标志物代谢通路及研究方法，其特征在于：采用核磁共振技术检测分析高糖高脂饮食加小剂量链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠及辣木籽干预后的血清代谢产物，获得代谢指纹图谱，利用多元变量统计分析筛选出十四个辣木籽潜在抗糖尿病相关血清标志物并进行鉴定；利用metaboanalyst在线分析软件筛选出辣木籽抗糖尿病的五个代谢通路网络并进行分析；获得辣木籽降糖的血清潜在标志物代谢通路的具体操作步骤如下：(1)辣木籽混悬液的制备：将剥好壳的辣木籽捣碎，研磨成100目的粉末,以适量质量浓度为1％羧甲基纤维素钠制成混悬液，其浓度为1g生药/ml，放入‑20℃冰箱冻存；(2)高脂高糖饲料重量配方：基础饲料66.5％，蔗糖20％，猪油10％，胆固醇2.5％，胆酸钠1％，加水做成条状并干燥；(3)动物模型的制备：造模大鼠选取200±20g重量的雄性SD大鼠36只，在室温为19～23℃，相对湿度为45～65％人工模拟自然环境条件下昼夜饲养，动物自由摄食饮水，适应1周后开始实验；随机取九只SD大鼠为空白组，空白组以普通饲料喂养，其余大鼠造模，4周后，造模大鼠禁食不禁水12h，以30mg·kg‑1单次小剂量腹腔注射1％STZ，30min内注射完毕，之后继续以高糖高脂饲料喂养直至实验结束；空白组注射等剂量的柠檬酸‑柠檬酸钠缓冲液作为对照；造模大鼠STZ注射72h后，7天后、11天后、18天后进行尾静脉采血检测血糖；以空腹血糖大于11.1mmol/L确定为糖尿病成模大鼠，造模成功的糖尿病大鼠按随机原则分为模型组和辣木籽治疗组，每组九只大鼠，辣木籽治疗组按0.2g生药/kg/d灌胃给药，空白对照组和模型组灌胃给予相同体积质量浓度为0.9％的氯化钠溶液，连续四周；(4)大鼠血清的保存和前处理：第四周末次给药后大鼠禁食不禁水12小时，用质量浓度为20％乌拉坦麻醉后，腹主动脉取血，血液收集后在转速3000rpm条件下离心10min，取上层血清样本保存于2mL的离心管中，每管1.5ml，冷藏于－80℃超低温冰箱，测定前从超低温冰箱取出血清样本并在冰上解冻，于4℃，12000rpm条件下离心10min以除沉淀，取0.4ml上清液移入5mm核磁样品管中，加入含四甲基硅烷0.2mg/mL的0.05ml重水中，充分混匀得到血清标本；(5)核磁共振检测：在室温25℃条件下，用Varian INOVA 600MHz NMR核磁共振仪检测步骤(4)的血清样本，采用Carr‑Purcell‑Merboom‑Gill CPMG脉冲序列进行检测，脉冲序列可以压制水峰和大分子的信号，从而检测血清中小分子代谢物；具体参数设置如下：谱宽8000Hz，采样点64k，弛豫时间为6s；采集时间为1.5s；自旋回波时间320ms，核磁共振具体参数如下：谱宽8000Hz，采样点64k，采样时间4s，弛豫延迟0s，均在弛豫延迟期间采用预饱和照射水峰；(6)核磁共振1H‑NMR图谱数据预处理：采用MestReNova核磁图谱专业处理软件对所有核磁共振1H‑NMR图谱进行相位、基线调整；在核磁共振NMR图谱中,以四甲基硅烷的化学位移δ0ppm为标准进行化学位移校正；以每段0.04ppm为单位，对δ0.01～6.00区域的谱图进行等宽度分割，去除δ4.60～5.60区域水峰，对图谱进行分段积分，将积分数据归一化处理，以txt文本格式保存；(7)利用多元变量统计分析并筛选潜在生物标志物：在获得核磁共振数据后，采用SIMCA‑P12.0软件对导入的对照组、糖尿病大鼠模型组、辣木籽治疗组三组血清样本数据进行主成分分析和偏最小方差判别分析；在三组血清样本的主成分分析PCA图中，糖尿病大鼠模型组与空白对照组分离良好，无交叉和重叠，说明两组代谢模式存在明显的差异，提示STZ致胰岛β细胞损伤可以引起明显的生理变化；辣木籽治疗组介于空白组和糖尿病大鼠模型组之间，与空白组有部分重叠，提示辣木籽治疗后糖尿病大鼠血清代谢模式出现改变，表明辣木籽对链脲佐菌素诱导的糖尿病模型大鼠的代谢紊乱有一定的干预作用；进一步采用有监督式方法进行建模分析，空白对照组、糖尿病大鼠模型组和辣木籽治疗组的偏最小方差分析PLS‑DA图中，辣木籽治疗组与空白对照组分离良好，无交叉和重叠；辣木籽治疗组介于与空白组和糖尿病模型组之间，更靠近空白组，提示辣木籽治疗后糖尿病大鼠血清代谢模式出现改变，更趋向正常，表明辣木籽有一定的抗糖尿病作用；对三组血清样本核磁共振数据进行偏最小方差分析PLS‑DA，得到空白对照组和糖尿病大鼠模型组的偏最小方差分析PLS‑DA载荷图，图中“S”曲线中每一个点代表1个变量，变量对分类的重要程度由相关系数的大小来衡量，变量越远离原点，相关系数值越大，对代谢物发生变化的贡献也越大，为了找到使其存在差异的潜在的生物标记物，选取S‑plot上“‑0.1～0.1”以外的变量作为有差异的潜在生物标记物，能够突显出空白组和糖尿病模型组差异的最大化合物，可被认为是与糖尿病代谢相关的潜在标志物，潜在生物标记物的化学位移为：0.88、0.96、0.96、1.32、1.48、2.04、2.16、3.24、3.40、3.48、3.88、3.40、3.42、3.44、3.52、3.56、3.72、3.76、3.84、3.92；(8)潜在生物标记物的鉴定及其含量变化：查阅已有的归属文献，同时搜索http://hmdb.ca/数据库，对找到的潜在生物标记物的化学位移进行鉴定，用SPSS软件对这些代谢物的峰面积进行独立样本t检验，得到与对照组比较具有显著差异P<0.05的十四个潜在生物标志物：牛磺酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、乳酸、谷氨酰胺、缬氨酸、脂质、N‑乙酰糖蛋白、亮氨酸、β‑葡萄糖、甘油、肌酸和α‑葡萄糖，其中脂质、亮氨酸、缬氨酸、乳酸、丙氨酸、N‑乙酰糖蛋白、谷氨酰胺这七个潜在标志物含量在糖尿病大鼠模型组中均降低，经辣木籽治疗后含量升高；牛磺酸、脯氨酸、甘氨酸、甘油、肌酸、α‑葡萄糖、β‑葡萄糖这七个潜在标志物在糖尿病大鼠模型组中均升高，经辣木籽治疗后含量降低，在MetaboAnalyst上对鉴定的潜在生物标记物进行代谢通路在线查询，有五个相关代谢通路参与了辣木籽抗高血糖的代谢过程，分别为丙氨酸‑天门冬氨酸‑谷氨酰胺代谢、缬氨酸‑亮氨酸‑异亮氨酸合成代谢、甘氨酸‑丝氨酸‑苏氨酸代谢、牛磺酸‑亚牛磺酸盐代谢和甘油脂代谢；(9)潜在生物标记物的分析：进一步利用MetaboAnalyst对鉴定的潜在生物标记物进行代谢通路重要性分析，通过代谢通路分析后所得影响值大小，依据代谢通路的p值和通路重要值，缬氨酸‑亮氨酸‑异亮氨酸合成代谢、牛磺酸‑亚牛磺酸盐代谢、甘油脂代谢、甘氨酸‑丝氨酸‑苏氨酸代谢和丙氨酸‑天门冬氨酸‑谷氨酰胺代谢这五个代谢通路为辣木籽抗糖尿病的重要代谢通路，参与了辣木籽抗糖尿病的主要代谢过程，形成相互交错的代谢网络，完整的阐释了辣木籽抗糖尿病的作用机制。