[发明专利]一株高产peptaibols抗菌肽的ΔTlrgt2木霉工程菌及其构建方法与应用

摘要

本发明涉及一株高产peptaibols抗菌肽的ΔTlrgt2木霉工程菌及其构建方法与应用。本发明通过Tlrgt2基因上下游同源臂序列、潮霉素抗性基因hph序列构建Tlrgt2敲除载体，采用基因敲除的方法制备得到ΔTlrgt2木霉工程菌株，敲除Tlrgt2基因，可以有效地提高菌株的peptaibols抗菌肽生产能力。本发明构建的ΔTlrgt2木霉工程菌可以稳定传代，并能够显著提高木霉peptaibols抗菌肽的产量，ΔTlrgt2木霉工程菌peptaibols抗菌肽产量比出发菌株提高约12倍，因此本发明有助于木霉peptaibols抗菌肽在医药和农业上的应用。

主权项

1.一株高产peptaibols抗菌肽的ΔTlrgt2木霉工程菌的构建方法，步骤如下：(1)提取木霉SMF2的基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，以upF、upR为上下游引物经PCR扩增得Tlrgt2基因上游同源臂序列，以downF、downR为上下游引物经PCR扩增得Tlrgt2基因下游同源臂序列，所述upF、upR、downF、downR的引物序列如下：upF：TGATTAGCCAGCCAGAGCAGCupR：CTTCAATATCATCTTCTGTCGACTGTTGCTCTCCTACCTCTCCGdownF：CTTGTTTCGGCGTGGGTATGATGTCGCTGTTGCCCGTACCAdownR：TTCAATTCTT TGTTCGCTCC TGGT(2)以质粒pUCATPH为模板，以hphF、hphR为上下游引物经PCR扩增得潮霉素抗性基因hph序列，所述hphF、hphR的引物序列如下：hphF：GTCGACAGAAGATGATATTGAAGhphR：CATACCCACGCCGAAACAAG(3)将步骤(1)和步骤(2)扩增得到的上游同源臂序列、下游同源臂序列、hph序列经纯化后，按照摩尔比1:1:3进行融合PCR扩增，得融合PCR产物；(4)以步骤(3)得到的融合PCR产物为模板，以CF、CR为上下游引物经PCR扩增得ΔTlrgt2敲除载体，所述CF、CR的引物序列如下：CF：GGTCCTCGTTCTCCATCTTCAGCR：TGTTGCTCTCCTACCTCTCCG(5)将步骤(4)得到的ΔTlrgt2敲除载体转化木霉SMF2原生质体，经再生、筛选及验证，得高产peptaibols抗菌肽的ΔTlrgt2木霉工程菌。