[发明专利]用于单细胞RNA测序的羊卵母细胞和卵丘颗粒细胞采集方法

摘要

本发明提供一种用于单细胞RNA测序的羊卵母细胞和卵丘颗粒细胞采集方法，通过对羊卵母细胞、卵丘颗粒细胞分别收集，可保证采样空间上的统一，无需整个卵巢研磨。收集后的卵母细胞和卵丘颗粒细胞可直接用于RNA提取或各种转录组高通量测序。与现有的采样绵羊整个卵巢进行RNA提取比较基因表达的方法相比，本发明的最大特点在于采样时空精准，可进一步提高卵巢采样用于分子试验的精确性。

主权项

1.用于单细胞RNA测序的羊卵母细胞和卵丘颗粒细胞采集方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)从屠宰场获取新鲜的母羊卵巢，经消毒后，选择直径大于3mm的单个卵泡，用装有预热DPBS缓冲液的注射器抽取卵泡液，得到卵泡液‑DPBS液；(2)去掉注射器针头，将卵泡液‑DPBS液从注射器推出至培养皿中，将装有卵泡液‑DPBS液的培养皿放置于热台上，在体视镜下观察，选取卵丘颗粒细胞包裹较好的CoCs；(3)用口吸管将CoCs转移至装有预热透明质酸酶溶液的培养皿中，然后用移液器反复吹打，直至在体视镜下观察到卵丘颗粒细胞全部脱尽，卵母细胞裸露出透明带为止；裸露的卵母细胞通过口吸管转移至预热的DPBS缓冲液中清洗，余下的溶液用于提取卵丘颗粒细胞；(4)用口吸管将步骤(3)中经DPBS缓冲液清洗后的卵母细胞转移至预热的链霉蛋白酶溶液液滴中作用一段时间，在体视镜下观察，直至可见透明带变形，但尚未开始消融，立即将卵母细胞通过口吸管转移至预热的DPBS缓冲液中清洗，进行后续细胞裂解及RNA提取操作；(5)步骤(3)中余下的溶液经离心，弃上清，收集卵丘颗粒细胞沉淀，加入预热的DPBS缓冲液重悬，然后进行细胞裂解及RNA提取操作。