[发明专利]一种改良的全长mRNA测序的建库方法在审
申请号: | 201811205646.8 | 申请日: | 2018-10-16 |
公开(公告)号: | CN109137086A | 公开(公告)日: | 2019-01-04 |
发明(设计)人: | 陈莹;潘旭;林春美;徐国标;赵燕燕;梁耀极 | 申请(专利权)人: | 梁耀极;爱默基因(厦门)生物科技有限公司;辽宁佰昊生物科技有限公司 |
主分类号: | C40B50/06 | 分类号: | C40B50/06;C12Q1/6806 |
代理公司: | 厦门市精诚新创知识产权代理有限公司 35218 | 代理人: | 秦华 |
地址: | 361000 福建省*** | 国省代码: | 福建;35 |
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摘要: | 本发明公开了一种改良的全长mRNA测序的建库方法。方法包括:首先进行polyA富集和RNA片段化:将所得加入逆转录引物AM‑SMART‑Oligo进行孵育后,加入试剂反应,再加入AM‑SMART‑Oligo反应得到第一链和第二链;纯化逆转录反应液后加入试剂,进行PCR扩增从而实现PCR富集,再纯化PCR产物。本发明所述方法建库速度快,操作简单,成本低,可检测全长转录本。 | ||
搜索关键词: | 建库 全长mRNA 测序 富集 改良 逆转录反应液 逆转录引物 试剂反应 第一链 可检测 转录本 孵育 | ||
【主权项】:
1.一种改良的全长mRNA测序的建库方法,其特征在于,步骤为,polyA富集和RNA片段化:将NEBNext Oligo d(T)25beads和RNA Binding Buffer进行充分混匀后,室温放置去除上清,再用2X RNA Binding Buffer重悬后加入RNA,进行PCR延伸,反复室温放置后重悬,用Wash Buffer将未结合的RNA去除;加入First Strand Synthesis Reaction Buffer孵育;第一链和第二链合成:向上述所得中加入逆转录引物AM‑SMART‑Oligo进行孵育后,再加入试剂42℃反应,再加入AM‑SMART‑Oligo反应得到第一链和第二链;优选的,加入逆转录引物AM‑SMART‑Oligo到上述得到的上清中,65℃孵育,反应后置于冰上;短暂离心,加入dNTP Mix,DTT,RNase Inhibitor,SMARTScribe RT,和RNase‑Free Water后反复吹打混匀,42℃反应;再加入逆转录引物AM‑SMART‑Oligo和SMARTScribe RT,充分混匀,42℃,90min;70℃5min,得到第一链和第二链;用Agencourt AMPure XP Beads纯化逆转录反应液:上述所得加入预先平衡到室温的AMPure XP Beads,充分混匀后室温孵育,磁力架放置使溶液完全清澈后去除上清;乙醇洗涤后去上清,乙醇挥发后加无核酸酶水混匀孵育,磁力架放置使溶液完全清澈后得到上清;PCR富集:向上述所得加入试剂后进行PCR扩增从而实现PCR富集步骤;纯化:用Agencourt AMPure XP Beads纯化PCR产物。
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