[发明专利]一种具有高let-7b成熟体表达量的单倍型鸡成肌细胞的构建方法

摘要

本发明公开了一种具有高let‑7b成熟体表达量的单倍型鸡成肌细胞的构建方法，其包括：1)单倍型表达载体克隆；2)鸡原代成肌细胞培养；3)细胞转染。采用3000Reagents方法分别对鸡原代成肌细胞转染5种单倍型重组质粒，获得5种具有高let‑7b成熟体表达量的单倍型成肌细胞。本发明构建出不同单倍型过表达载体，并转染至鸡原代成肌细胞以测定不同单倍型对let‑7b成熟体表达量的影响，从而获得具有高let‑7b成熟体表达量的单倍型鸡成肌细胞，推断出其表达量差异的原因是因为let‑7b前体区上不同的SNP影响let‑7b前体加工过程，从而导致let‑7b成熟体表达量差异。

主权项

1.一种具有高let‑7b成熟体表达量的单倍型鸡成肌细胞的构建方法，其特征在于包括如下步骤：1)单倍型表达载体克隆a、根据let‑7b前体区基因序列测序结果，设计引物对，目的片段包含g.270G>A、g.526G>A、g.678T>C和g.710G>C 4个突变位点，同时在设计的引物对的5'端加上酶切为点和保护碱基后，进行单倍型基因PCR扩增，得PCR产物；b、PCR产物进行回收、纯化，获得纯化的含有目的片段的DNA液，备用；c、采用PcDNA3.1菌种进行菌液扩繁，抽提PcDNA3.1环状质粒并获取纯化的DNA样品；d、用内切酶分别对步骤b所得的含有目的片段的DNA液和步骤c所得的DNA样品进行双酶切处理，经纯化双酶切产物后获得目的基因片段和pcDNA3.1(+)质粒载体；e、使用T4DNA Ligase将步骤的d所得的目的基因片段分别与pcDNA3.1(+)质粒载体连接，将连接产物进行转化，再进行摇菌扩繁处理，获得构建成功的5种单倍型重组质粒；2)鸡原代成肌细胞培养利用孵化11d的鸡种蛋分离出成肌细胞，纯化处理，备用；3)细胞转染采用3000Reagents方法分别对鸡原代成肌细胞转染5种单倍型重组质粒，获得5种具有高let‑7b成熟体表达量的单倍型成肌细胞。