[发明专利]一种基于纳米金比色的microRNA-7a快速检测方法

摘要

本发明公开了一种基于纳米金比色的microRNA‑7a快速检测方法。利用单链DNA和双链DNA的静电性差异，与金纳米在高盐浓度下的不同相互作用（颜色变化）对靶目标进行比色检测，且结合紫外可见光谱仪检测其吸光度值间接检测靶目标的浓度。本发明的检测浓度下限达到5.3nmol/L，线性回归方程为A=0.002C+0.238，r=0.990。该方法不仅能对未标记的microRNA‑7a进行特异性分析，且能很好地区分单碱基错配序列，特异性强，方法简便，分析速度快，肉眼可视目标物的浓度检测下限，能够较好地广泛应用到实际检测中。

主权项

1.一种基于纳米金比色的microRNA‑7a快速检测方法，其特征在于具体步骤为：（1）金纳米粒子的制备：移取100 mL质量百分比浓度为0.01%的氯金酸溶液倒入圆底烧瓶中，将其放置油浴锅中加热煮沸后迅速加入1.5mL 质量百分比浓度为1%的柠檬酸钠溶液作为还原剂，继续加热15分钟，观察溶液的颜色从最初的淡黄色逐渐变成酒红色，最后停止加热冷却至室温，并且全程处于搅拌状态下进行,得到粒径为24nm的纳米金粒子；（2）设计与目标物miRNA‑7a互补的碱基数22~40mer探针Probe；（3）将终浓度为5.33 ~259.74 nmol/L的目标物miRNA‑7a与物质的量为40~200pmol，碱基数为22~40mer探针Probe混合后，置于33~43℃下杂交30分钟，得杂交混合溶液；（4）将步骤（3）所得杂交混合溶液置于200μL步骤（1）所得的金纳米粒子溶液中震荡混匀,在室温下静置10分钟；（5）往步骤（4）所得混合液中加入100μL含60~200 mmol/L NaCl浓度为10 mmol/L pH7.4磷酸盐缓冲溶液，平衡2分钟后，使用数码相机拍照做颜色对比；（6）使用紫外可见光谱仪对步骤（5）所得溶液进行检测，分别在524nm和700nm出现特征峰；记录浓度分别为5.33~259.74 nmol/L目标物miRNA‑7a的紫外光谱；（7）检验方法的特异性：经过一系列的优化实验，得到最佳的实验条件，即探针probe的碱基数为34mer，NaCl的浓度为大于或者等于160mmol/L，探针probe物质的量为80pmol，杂交温度为30℃；在最优的实验条件下，分别取与目标物miRNA‑7a同种类的序列浓度为131.57 nmol/L的miRNA‑7d、miRNA‑7e、miRNA‑7g以及0nmol/LmiRNA‑7a按照步骤（2）~（6）进行实验操作，记录浓度为0 nmol/L miRNA‑7a、131.57 nmol/L的miRNA‑7a、miRNA‑7d、miRNA‑7e、miRNA‑7g的紫外光谱；所述的34mer探针probe的碱基序列为：5´‑TTTTTTAACTATACAACCTACTACCTCATTTTTT‑3´，miRNA‑7a的碱基序列为：5´‑TGAGGTAGTAGGTTGTATAGTT‑3´，miRNA‑7d的碱基序列为：5´‑AGAGGTAGTAGGTTGCATAGT‑3´，miRNA‑7e的碱基序列为：5´‑TGAGGTAGGAGGTTGTATAGT‑3´，miRNA‑7g的碱基序列为5´‑TGCGGTAGTAGTTTGTACAGTA‑3´。