[发明专利]高山杜鹃农杆菌介导的整株感染法的高效遗传转化方法

摘要

本发明公开一种高山杜鹃农杆菌介导的整株感染法的高效遗传转化方法。该方法主要包括：种子预培养、超声波处理、农杆菌菌液制备、农杆菌侵染及真空抽滤、共培养、脱菌清洗、萌发培养、GUS组织化学染色。本发明方法操作简单、实验成本低、转化周期短、遗传转化效率高达61％，该方法将可应用于杜鹃属其它植物的遗传转化。

主权项

1.一种高山杜鹃农杆菌介导的整株感染法的高效遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)种子预培养将灭菌后的高山杜鹃种子浸泡在pH＝5.2的含有0.03g/L的GA3的1/2MS液体培养基中，于摇床上25℃，120rpm条件下慢速震荡培养24h，然后转移至装有用1/2MS液体培养基浸湿滤纸的平皿中，于25℃±2℃条件下进行黑暗预培养3天；(2)超声波处理将预培养后的种子转移至装有1/2MS液体培养基的三角瓶中，于工作频率为35kHz，功率为100W的超声波下处理15min；(3)农杆菌侵染液制备挑取农杆菌单菌落进行活化，之后取活化的菌液接种于含有100mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的YEB培养基中进行扩大培养至OD600＝0.6～0.8，然后于4℃，400rpm低速离心收集菌液，将收集的菌液用含5g/L蔗糖和100uM乙酰丁香酮的1/2MS液体培养基重悬至OD600＝0.8～1.0，静置50～60min后再加入Silwett L‑77得到农杆菌侵染液，其中Silwett L‑77的终浓度为0.2％v/v；(4)农杆菌侵染及真空抽滤将步骤(2)超声波处理后的种子转移至装有步骤(3)制备所得的农杆菌侵染液的三角瓶中，盖上膜盖，于摇床上28℃、120rpm低速震荡培养30min，然后再将揭掉膜盖的三角瓶放入真空泵中进行真空抽滤；(5)共培养真空抽滤结束后，将种子转移到无菌滤纸上控干，然后转接到含有100uM乙酰丁香酮的1/2MS固体培养基中于25℃±2℃下黑暗共培养3天；(6)脱菌清洗先用ddH2O清洗共培养后的种子2～3次，再用含200mg/L头孢霉素纳的ddH2O清洗种子2～3次，然后于无菌滤纸上控干；(7)萌发培养将步骤(6)控干后的种子播种到含200mg/L头孢霉素纳的1/2MS固体培养基上进行萌发培养，温度为25℃±2℃，光照强度为700μmol/m2·s，每天14小时光照、10小时黑暗；(8)GUS组织化学染色法检测转基因植株待步骤(7)萌发培养的种苗长出5～6片叶子后，取带根的完整植株进行GUS组织化学染色，检测高山杜鹃转基因植株，同时用未进行农杆菌侵染的高山杜鹃植株作阴性对照材料。