[发明专利]一种用于区分梅毒早晚期感染的方法

摘要

本发明涉及一种用于区分梅毒早晚期感染的方法，利用分子生物学基因克隆表达技术，获得梅毒TP0136重组蛋白，以纯化的梅毒TP0136重组蛋白作为抗原，建立检测TP0136抗体的ELISA方法并组装成试剂盒，基于梅毒感染者TP0136抗体水平来区分早晚期感染，有利于指导临床合理用药，避免过度治疗，为梅毒的诊治提供一种快速、简便的检测方法。通过检测TP0136抗体水平区分梅毒感染时期，弥补了梅毒分期诊断检测方法的空白；具有检测通量大、结果确切、灵敏度高、操作简单的特点，易于基层推广。

主权项

1.一种用于区分梅毒早晚期感染的方法，采用含有梅毒螺旋体TP0136抗原蛋白，包括如下步骤：Step.1梅毒螺旋体菌株的传代和分离：梅毒螺旋体Nichols株通过睾丸内接种法，在新西兰白兔睾丸中繁殖和提取；Step.2从兔睾丸组织中提取梅毒螺旋体DNA：从感染兔睾丸中提取的螺旋体经低速离心，使用微量离心机离心沉淀梅毒螺旋体。重新悬浮梅毒螺旋体于1X细胞溶解缓冲液中，重新悬浮梅毒螺旋体冷冻于‑20℃或根据需要应用QIAamp DNA Mini试剂盒(QIAGEN)提取DNA，按说明书操作提取DNA，提取后DNA储存于‑20℃；。Step.3TP0136序列分析和引物设计：从Genbank的蛋白质和DNA资料库中搜索TP0136氨基酸和核酸序列，应用BioEdit 7.1软件对密螺旋体属的5个梅毒苍白密螺旋体(Nichols、DAl‑1、Chicago、Mexico A和SS14)、3个雅司苍白密螺旋体(Samoa D、CDC2和Gauthier)和1个未分类的类人猿密螺旋体(Fribourg‑Blanc)进行多重序列比对；Step.4应用引物设计软件对GenBank查询到Nichols标准株TP0136基因序列进行引物设计，用SignalP4.1Server软件预测TP0136信号肽，TP0136开放阅读框架引物不含信号肽；Step.4梅毒螺旋体TP0136DNA扩增：常规PCR扩增梅毒螺旋体Nichols株TP0136DNA。上游引物(Fp)为:ATGACGTGCGATTTCACTGG(SEQ ID No:2)；下游引物(Rp)为：CTCGCGGTTCCAGGAGCACG(SEQ ID No:3)。加入PCR扩增反应试剂在95℃变性10min；95℃变性1min、60℃变性2min、72℃变性1min，重复以上变性共45个循环；最后一次72℃延伸10min，扩增PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定；Step.5重组表达质粒的构建：PCR产物克隆入pPEX 5‑CT载体(Invitrogen)。载体导入TOP10感受态大肠杆菌(Invitrogen)中：将反应管孵育在22℃下5 分钟；随后将反应管置于冰上反应，并将TOP10感受态大肠杆菌也置于冰上，TOP10感受态大肠杆菌储存温度为‑80℃；制备水浴锅至42℃；将S.O.C.试剂置于室温复温；将含有100μg/mL氨苄青霉素的LB板置于37℃温箱30分钟；冰上解冻感受态细胞；添加2μl载体反应液到TOP10感受态大肠杆菌，轻轻混匀；在冰上孵育5到30分钟；在42℃热休克感染态细胞30秒，不能晃动；立即将反应管转移到冰上3分钟；添加250μl室温复温的S.O.C.试剂；拧紧试管帽，37℃200转水平摇晃1小时；取100μl，均匀涂抹于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB板，37℃孵育过夜；高效克隆反应会产生数百个菌落，挑选10个菌落，用常规PCR法验证转化子；取转化正确的转化子摇菌过夜，质粒小提试剂盒(Qiagen)提取质粒；Step.6重组蛋白的表达和纯化：经测序验证正确的pPEX 5‑CT‑TP0136表达载体转化到感受态大肠杆菌Rosetta细胞(Merck KGaA，德国)，在第一天将转化子置于LB+1％葡萄糖琼脂板上，处理以抗生素，抗生素含氨苄青霉素100μg/mL，放置在37℃的培养箱中过夜；第2天上午，从新鲜琼脂平板转移菌落于2mL ZYP‑0.8G或LB+1％葡萄糖，加上抗生素，抗生素含氨苄青霉素100μg/mL，置于18×150毫米的卡扣帽管中，以300RPM在37℃下摇菌3‑4小时，直到培养变混浊，准备5个2升的烧瓶，每个烧瓶加入400mL ZYMP‑5052培养基和抗生素，抗生素含氨苄青霉素100μg/mL；在第2天凌晨，转移200μl接种物培养到含有400mLZYP‑5052+抗生素的2升烧瓶中，以220RPM在室温下摇菌72小时，在第5天上午，将含有该培养物的烧瓶置于冰桶中冷却，待培养物冷却后，从每个烧瓶中取1.0mL培养物，并将其放置在标记了的1.5mL离心管中，用500μl SDS‑PAGE样品缓冲液重新悬浮培养物，煮沸样品10分钟后，用台式离心机13000转离心5分钟，将清澈湛蓝的上清液装于新的1.5mL离心管中，剩余的沉淀细菌重新离心2分钟，去上清液，用免疫印记法验证含6xHis标签的蛋白：表达的蛋白通过SDS‑PAGE分离并转移到硝化纤维素膜后，用抗6xHis抗体(Sigma)检测证实TP0136为不溶性蛋白质；将烧瓶中的培养物分装于0.3升的离心瓶中，在4℃下6000×g离心10分钟沉淀细菌，倒出上清液，沉淀存于‑80℃低温；每1升沉淀物用30mL冷的1X结合缓冲液进行重悬，如果蛋白是不可溶的，加入0.1％NP‑40到结合缓冲液；超声波处理器GEX130(Cole‑Parmer)对重悬沉淀进行超声处理5分钟，尽量避免形成泡沫，超声处理后，在13000rpm下离心15分钟；去上清，每1升沉淀用30mL冷的1×结合缓冲液(不含NP‑40)进行重悬，再次超声处理和13 000rpm下离心15分钟，去上清，每1升沉淀用80mL 1X结合缓冲液+6M盐酸胍进行重悬，在4℃磁力搅拌器上孵育过夜；用Sorvall RC‑5B冷冻超高速离心机(Thermo Scientific)20 000rpm离心30分钟，回收上清液，并通过一个45微米的过滤器过滤；将5mL50％的树脂/缓冲液加到15mL锥形管中，1 000rpm离心5分钟，去除上清液，加入10mL双蒸水，室温下震荡10分钟，1 000rpm离心5分钟，去除双蒸水；再次加入10mL双蒸水，室温下震荡10分钟，1 000rpm离心5分钟，去除双蒸水，加10–12mL1X结合缓冲液(含6M盐酸胍)，在室温下孵育10分钟，1 000rpm离心5分钟，去除结合缓冲液；再次加10‑12mL1X结合缓冲液(含6M盐酸胍)，在室温下孵育10分钟，1 000rpm离心5分钟，去除结合缓冲液，在最后一次洗涤后，将树脂转移到亲和层析柱(Bio‑Rad)并等待其沉降；将过滤后上清液加入到含Ni‑NTA琼脂糖(Qiagen)的亲和层析柱(Bio‑Rad)中，4℃保存的Ni‑NTA琼脂糖(Qiagen)在使用前应充分混合，用15mL 1X结合缓冲液(含6M盐酸胍)清洗树脂；用10mL洗涤缓冲液(含6M盐酸胍)清洗树脂；收集清洗下的洗涤缓冲液，装于1.5mL离心管中，每管含1mL收集清洗下的洗涤缓冲液，用于后续的SDS‑PAGE分析；用10mL洗脱缓冲液(含6M盐酸胍)洗脱蛋白质，收集清洗下的洗脱缓冲液，装于1.5mL离心管中，每管含1mL收集清洗下的洗脱缓冲液，用于后续的SDS‑PAGE分析；分次收集的洗涤缓冲液和洗脱缓冲液经SDS‑PAGE和简蓝安全染色液(Life Technologies)染色分析，以确定不含污染物的洗脱液；在进行SDS‑PAGE检测前，含盐酸胍的分次收集的洗涤缓冲液和洗脱缓冲液用三氯乙酸(TCA)/丙酮沉淀蛋白；通过SDS‑PAGE验证最纯净的不含污染物的洗脱液在4℃下置于透析盒(Thermo Scientific)透析，透析液为含有逐渐减小浓度的盐酸胍(从3M、1.5M、1M、0.5M到0M)的1×PBS，通过离心分离将透析后再次重折叠的可溶性蛋白从沉淀中分离出，重组蛋白储存于‑80℃低温下；Step.7制备可用于检测TP0136抗体的试剂盒；Step.8使用试剂盒区分梅毒早晚期感染。