[发明专利]一种白细胞介素-6的制备方法

摘要

本发明提供了一种白细胞介素‑6的制备方法，该技术方案首先研究了影响IL‑6天然基因表达效率的因素，并探索了外源性DNA与L‑6天然基因重组的可行性，以此为依托，对各类外源基因进行了筛选。意外发现整合有蓝色犁头霉部分结构基因的DNA片段对IL‑6蛋白的表达具有显著的促进作用。在此基础上，本发明以密码子的偏好性为依据筛选表达系统，最终构建了全新的木糖葡萄球菌表达系统；针对异源表达不稳定的问题，本发明对上述DNA片段进行了结构改进，利用Ase I将末端部分碱基切除，并设计了替换性序列，将其与pCMV‑MCS质粒双酶切后连接，所得的重组载体通过电击转化方法导入感受态的木糖葡萄球菌中，实现异源表达。

主权项

1.一种白细胞介素‑6的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1)提取人外周血T淋巴细胞总DNA，以如下序列的DNA片段为一对引物，执行PCR扩增：5’‑TTCTAGCAAGCTGGGTCAGATC‑3’；5’‑CGGATGATGCATGACTTGGACC’；得到第一目的基因；2)提取蓝色犁头霉总DNA，以如下序列的DNA片段为一对引物，执行PCR扩增：5’‑TCTGGAGCTAGAATCAAGGA‑3’；5’‑ATCGTCATGCATTGTCAGAAT‑3’；得到第二目的基因；3)用限制性内切酶Hind III分别酶切所述第一目的基因和第二目的基因，而后通过T4DNA连接酶将二者连接，即得到第三目的基因；合成如下序列的DNA片段：5’‑CCATCTGCTCAGCGCATGGAACTAGCTTGTACTAAGAGCAGTCGGCT‑3’；用限制性内切酶Ase I分别酶切该DNA片段以及所述第三目的基因，而后通过T4DNA连接酶将二者连接，即得到重组表达基因；4)用限制性内切酶BamH I与Pst I同时酶切所述多元表达基因和pCMV‑MCS载体，而后通过T4DNA连接酶将二者连接，即得到重组表达载体；5)取木糖葡萄球菌接种于MRS培养基中，培养至菌液OD630值为0.5；将菌液冰浴40min后，离心取沉淀；用0.15mmol/L的氯化钠溶液l0mL重悬沉淀，而后离心取沉淀，再悬浮于20mmol/L的氯化钙溶液中，得到感受态的木糖葡萄球菌；6)在电转杯中，将4μg步骤4)所述重组表达载体与150μL步骤5)所述感受态的木糖葡萄球菌混合，而后以电压1.3kv、电阻230Ω、电容21uF的条件电转6.7ms；筛选阳性克隆，即得到重组表达菌株；7)取步骤6)所得的重组表达菌株，在MRS培养基中培养至菌液OD630值为0.3，而后向其中加入等体积、等浓度的副干酪乳杆菌水悬液，调整pH至5.1，继续培养15h；而后向菌液中加入0.8mmol/L的LY294002，在32℃条件下诱导表达6h；8)取步骤7)诱导表达后的菌体，裂解获得包涵体，加入变性缓冲液溶解变性，再加入复性缓冲液进行稀释复性，而后将复性后的蛋白执行层析纯化。