[发明专利]一种免疫增强型重组PRRSV病毒样颗粒亚单位疫苗的制备方法

摘要

本发明公开了一种免疫增强型重组PRRSV病毒样颗粒亚单位疫苗的制备方法，由PRRSV病毒样颗粒和复合免疫佐剂组成。本发明通过基因工程的手段，改造了PRRSV GP5‑M基因，通过构建杆状病毒表达载体制备得到具有高免疫原性的PRRSV病毒样颗粒。另外，本发明通过免疫佐剂的改进，得到了一种免疫增强型重组PRRSV病毒样颗粒亚单位疫苗，该亚单位疫苗具有更好的免疫效果。

主权项

1.一种免疫增强型重组PRRSV病毒样颗粒亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将重组杆状病毒Ac‑PRRSVGP5‑M按5‑10%比例接种健康sf9细胞，27℃培养4‑5天后，反复冻融收集细胞及上清，于4℃条件下12000r/min离心20分钟后收集上清，然后使用硫酸铵沉淀法将目的蛋白沉淀，重悬后使用二乙烯亚胺对蛋白溶液进行36‑48小时灭活，之后使用等量硫代硫酸钠中和，采用0.9%的生理盐水调整至蛋白含量为100μg/mL，最后与复合免疫佐剂混合乳化配制疫苗，置于2‑8℃备用；所述复合免疫佐剂由以下重量百分含量的组分组成：蜂胶提取物 1%，鱼腥草多糖 1.5%，丙氨酸0.5%，银杏叶黄酮1.5%，聚乙烯蓖麻油 7%，Span80 7%，聚乙二醇 3.5%，角鲨烯8%，注射用大豆油 40%，注射用水30%；所述复合免疫佐剂的制备方法包括如下步骤：步骤一，按重量百分含量配比称取各原料；步骤二，将称取的蜂胶提取物、鱼腥草多糖和丙氨酸与注射用水混合，搅拌至其充分溶剂，得到水相；步骤三，将称取的银杏叶黄酮与角鲨烯、注射用大豆油混合，搅拌均匀，得到油相；步骤四，将称取的聚乙烯蓖麻油、Span80与聚乙二醇混合，然后加入步骤三所制得的油相，在650rpm的转速下搅拌4min，得到均匀的油相混合物；步骤五，将步骤四制得的油相混合物在580rpm的转速下搅拌，边搅拌边以每分钟150微升的速度滴加步骤二所制得的水相，待形成澄清透明的纳米乳后，改为每分钟600微升继续添加步骤二所制得的水相，直至水相全部滴加完成，即得到所述的复合免疫佐剂；所述蜂胶提取物采用如下方法制备得到：①称取100g研碎后蜂胶，用滤纸包成5包，每包20g，放入烧杯中；②烧杯中加入400mL的水，水浴加热，加热温度为75℃，加热时间为1h；③停止加热后，将包好的5包蜂胶取出放入漏斗中滤干液体，滤出的液体倒入烧杯中，冷却后，置于 4℃冰箱中保存过夜；④待水提物液面出现凝结成块的蜂蜡，用布氏漏斗对水提物进行抽滤除掉蜂蜡，滤液进行真空冷冻干燥，干燥至含水量低于5%，即得到所述的蜂胶提取物；所述重组杆状病毒Ac‑PRRSVGP5‑M的制备方法包括如下步骤：步骤一，表达PRRSV GP5与M蛋白的重组杆状病毒的构建，通过下述步骤制备获得：（1）PRRSV的免疫原性基因GP5与M的串联基因GP5M的人工修饰合成：比对分析2006‑2016年间PRRSV流行毒株的基因序列，根据田间流行优势毒株氨基酸特征与密码子的偏嗜性，并根据免疫原性的需要，对其进行了基因改造后，人工合成GP5‑M基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示；（2）杆状病毒转移载体的构建：以pBAC5质粒为骨架，通过Xba I与BamH I酶切载体与插入片段，然后通过T4连接酶于16℃过夜连接，转化筛选阳性克隆，提取重组质粒，酶切鉴定，获得杆状病毒转移载体pBAC‑PRRSVGP5‑M；步骤二，重组杆状病毒Ac‑PRRSVGP5‑M的构建：（1）重组杆粒rBac‑PRRSVGP5‑M的获得与鉴定：取测序鉴定正确的杆状病毒转移载体pBAC‑PRRSVGP5‑M质粒DNA与DH10 Bac感受态细胞混合，冰浴30分钟后，于42℃进行45秒水浴热激，然后冰浴5分钟，加入SOC液体培养基，37℃振荡培养2小时，按10倍系列稀释之后，各梯度菌液涂布LB平板，使用life公司的筛选试剂盒筛选纯化阳性菌落，提取重组杆粒rBac‑PRRSVGP5‑M；（2）重组杆状病毒Ac‑PRRSVGP5‑M的获得：将上一步提取的重组杆粒rBac‑PRRSVGP5‑M，使用脂质体转染试剂Lipofectamine3000，转染至sf9细胞中，在28℃持续培养观察，于转染后24小时、48小时与72小时利用荧光显微镜观察重组杆状病毒绿色荧光信号，并于转染后72小时收集细胞上清，得到重组杆状病毒，然后将其再次接种健康sf9细胞扩大培养，收集病毒液作为毒种置于‑70℃保存备用。