[发明专利]一种提高棉秆生物质降解及糖醇转化效率的研究方法

摘要

本发明公开了一种提高棉秆生物质降解及糖醇转化效率的研究方法，研究了汽爆后秸秆细胞壁组分及其精细结构和预处理降解效率，并探讨分析了它们之间的关系，为棉秆的有效利用提供了理论基础。本发明通过对陆地棉和海岛棉棉秆的研究比较发现，海岛棉比陆地棉更适宜于作为能源植物，并利用其生物质能转化生产生物乙醇。确定了影响棉秆降解效率的细胞壁组分关键性结构因子是纤维素的聚合度，汽爆+0.25％H2SO4二步法通过极大地降低纤维素聚合度，使得降解效率系原样提高了5‑6倍。

主权项

1.一种提高棉秆生物质降解及糖醇转化效率的研究方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、材料预处理1.1汽爆处理1)材料准备将汽爆备用的棉秆切剪成5‑8cm片段，并喷洒去离子水使材料湿度达到50％，处理后室温储存以备汽爆；2)汽爆处理将200.0000g的备用棉秆放置于汽爆罐中进行汽爆处理；汽爆参数：225℃，3minute，2.25Mpa/3min；汽爆后经中药粉碎机粉碎并过40目筛，过筛后的茎秆样品置于50℃恒温干燥箱中烘干至恒重；1.2生物质稀酸预处理及酶解；1.3生物质稀碱预处理及酶解；步骤2、细胞壁组分提取和测定2.1细胞壁主要多糖成分提取；2.2细胞壁木质素含量测定；2.3比色法测定六碳糖和五碳糖1)制作以葡萄糖为标准样品的六碳糖标准曲线取1.0000mg/mL葡萄糖标准溶液2.00mL，4.00mL，6.00mL，8.00mL，10.00mL于100.00mL容量瓶中，加水定容，再分别取上述各溶液1.00mL于10.00mL具塞玻璃试管中，加入2.00mL硫酸蒽酮试剂快速摇匀，在沸水中加热5min，自来水冷却至室温，620nm比色，1.00mL的蒸馏水作空白样品；2)制作以木糖为标准样品的五碳糖标准曲线取1.00mg/mL木糖标准溶液0.50mL，1.00mL，2.00mL，3.00mL，4.00mL于100.00mL容量瓶中，加水定容，再分别取上述各溶液1.00mL于10mL具塞玻璃试管中，先加入134.00μL A试剂，A＝6.000g苔黑酚溶于100.00mL无水乙醇中，再加入2.00mL B试剂，B＝0.1000g FeCl3溶于100.00mL 37％浓盐酸中，混匀后，在沸水中加热20min，自来水冷却至室温，660nm比色，1.00mL的蒸馏水作空白样品；2.4纤维素结晶度测定使用广角X‑射线粉末衍射仪表征纤维素的结晶度；测试条件为：Cu靶，Kα射线，λ＝0.15406，管压40.00kV，管流40.00mA，扫描速度为10°/min，步长为0.02°，发散狭缝DS：1°，接收狭缝RS：0.30mm，防散射狭缝SS：1°，扫描范围5～45°；纤维素的结晶度通过比较基线以上2θ＝18°Iam处的最低峰高和2θ＝22.5°I200处的最强峰高，来进行计算；计算公式为(CrI％＝100×(I200–Iam)/I200)；2.5纤维素聚合度(DP)纤维素的聚合度DP采用粘度法测定，粘度计型号为0.7～0.8mm乌氏粘度计；相对粘度η相对与特性粘度[η]的关系根据美国药典中粘度表计算得出，聚合度按照修正公式[η]＝190DP计算得到；2.6GC‑MS测定单糖组成1)取2.50mL样品到5.00mL螺口玻璃管中，加入100.00uL 2.00mg/mL的肌醇IS，再加入500.00uL三氟乙酸TFA，120℃水解1h；2)冷却后，2100g离心5min，取2.00mLTFA水解液40℃真空抽干，加蒸馏水至800.00uL，震荡溶解；3)溶液中加入0.40M新配的10％NaBH4溶液，于40℃水浴中保温30min，使糖完全还原为糖醇；再分别加入0.80mL冰醋酸，以中止过量的10％NaBH4溶液得到还原液，这一步反应十分剧烈，需缓慢滴加；4)取还原液0.40mL，加0.60mL甲基咪唑和4.00mL醋酸酐，在室温下乙酰化反应10min，再分别加入10.00mL蒸馏水分解过量的醋酸酐，冷却至室温后，加入3.00mL二氯甲烷，震荡混匀，静置过夜；5)吸去上层水相后，加入20.00mL蒸馏水，震荡混匀，静置分层后吸掉水相，重复操作3次至无醋酸；得到下层二氯甲烷，加入适量的无水Na2SO4脱水干燥，上机检测；6)以上所有步骤均使用玻璃器材，不能使用塑料制品；2.7HPLC测定木质素单体组成；步骤3、棉秆发酵3.1预处理上清液发酵称取0.5000棉秆秸秆粉末于15.00mL离心管，分别加10.00mL不同浓度NaOH，充分浸湿秸秆后置于摇床中50℃、150r/min处理2h；冷却至室温后2100g，离心5min；上清液转移至20.00mL离心管，残渣用5.00ml单蒸水水洗两次并收集；2.00mL HCl将所有上清液中和至pH 4.8，用pH 4.8磷酸缓冲液定容至20.00ml；根据秸秆粉末的重量和NaOH预处理产糖数据计算出预处理液所含的六碳糖，再补加葡萄糖至4.0000g；把上述20.00ml预处理液倒入装有葡萄糖的8cm×18cm试管，即发酵起始六碳糖浓度为20.0％(w/v)；121℃高压灭菌20min；用pH 4.8磷酸缓冲液配制4.0％(w/v)酵母种子液，于38℃水浴锅中复水活化30min，取1.00mL加到发酵液20.00mL中，即接种量为0.2％(w/v)；37℃恒温培养箱里静置发酵48h，发酵结束后置于4℃冰箱保存，逐一蒸馏测定乙醇；3.2酶解上清液发酵在上述碱性预处理后的残渣上加10.00mL蒸馏水，2100g，离心5min，重复5遍，直至把残渣水洗到中性；再加10.00mLpH 4.8磷酸缓冲液，2100g，离心5min，倒掉上清；残渣加5.00mL0.4％(w/v)纤维素复合酶，定容至10.00mL，50℃，150r/min处理48h；酶解后，2100g，离心5min，上清液定容至10.00mL用于发酵；根据秸秆粉末的重量和酶解效率数据计算出酶解液所含的六碳糖，再补加葡萄糖至2.0000g；把上述10.00mL酶解液倒入装有葡萄糖的8cm×18cm试管，即发酵起始六碳糖浓度为20.0％(w/v)；121℃高压灭菌20min；用pH 4.8磷酸缓冲液配制4.0％(w/v)酵母种子液，于38℃水浴锅中复水活化30min，取0.50mL加到发酵液10.00mL中，即接种量为0.2％(w/v)；37℃恒温培养箱中静置发酵48h，发酵结束后置于4℃冰箱保存，逐一蒸馏测定乙醇；3.3测定发酵液乙醇含量重铬酸钾法测定乙醇的方法：1)制备标准曲线分别取0.00μL、5.00μL、10.00μL、15.00μL、20.00μL、25.00μL、30.00μL无水乙醇于10.00mL具塞玻璃试管中，补蒸馏水至1.00mL，加入2.00mL 5％K2Cr2O7，混匀后沸水浴10min，迅速冷却；再加7.00mL蒸馏水混匀后，在600nm可见光波长处比色；以1.00mL蒸馏水为对照；2)发酵液乙醇含量的测定发酵液补蒸馏水至50.00mL，蒸馏出20.00mL；把上述样品按一定比例稀释后取1.00mL于10.00mL比色管，再加入2.00mL 5％K2Cr2O7，混匀后沸水浴10min，迅速冷却；再加7.00mL蒸馏水混匀后，在600nm可见光波长处比色；以1.00mL蒸馏水为对照；步骤4、数据统计分析实验所得结果利用SPSS软件进行双变量的Spearman相关性分析和双尾方向的显著性水平检验，以P值小于0.05定义为具有统计学显著性差异；以P值小于0.01定义为具有统计学极显著性差异；标注：Spearman等级相关，指根据等级指标来研究两个变量之间相互关系的一种方法；其对于数据基本条件的要求低于积差相关，只需要两变量的测定值是对的等级评定数据，或是由连续变量的观测值转化获得的等级数据，不管两个变量的样本容量大小及总体分布形态如何，都采用Spearman等级相关来进行数据相关性的分析及研究。