[发明专利]一种发根农杆菌介导的烟草红花大金元转化方法

摘要

本发明涉及一种发根农杆菌介导的烟草红花大金元转化方法，属于植物基因工程领域。该方法包括如下步骤：烟草红花大金元种子的消毒、烟草幼苗植株培养、烟草叶盘预培养、发根农杆菌的菌液制备、侵染与共培养、发状根培养、发状根愈伤组织培养、分化芽培养和再生植株生根培养。本发明通过发根农杆菌介导的烟草转化技术，建立发根农杆菌在烟草红花大金元转化上的稳定再生体系，该方法同时可以使转化再生植株具有较高生根率，以及较高的转化效率。

主权项

1.一种发根农杆菌介导的烟草红花大金元转化方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤（1），烟草红花大金元种子的消毒；步骤（2），烟草幼苗植株培养：将步骤（1）得到的种子接种到MS培养基中，使得该种子发芽长成幼苗；步骤（3），烟草叶盘预培养：从步骤（2）中得到的幼苗上获取烟草叶盘，将烟草叶盘置于MS培养基中进行预培养；步骤（4），发根农杆菌的菌液制备：将带有编辑PDS基因片段的质粒转入发根农杆菌，将转化后的发根农杆菌置于含有相应抗生素的YEB固体培养基上培养，黑暗培养2‑3d；挑取将含有目的质粒的发根农杆菌在含有相应抗生素的YEB液体培养基中进行28℃黑暗培养，然后按照1：50比例进行液体振荡扩大培养，待培养至菌液浓度为OD600 =0.5‑0.8，进行菌体收集，最后利用MS液体培养基悬浮菌体至OD600 =0.6‑0.8，待后续试验所用；步骤（5），侵染与共培养：将步骤（3）中预培养3d左右的烟草叶盘浸入步骤（4）的菌液中10min左右，取出叶盘在灭菌滤纸上吸干菌液，并放至MS培养基上共培养3d左右；步骤（6），发状根培养：将步骤（5）中共培养后的叶盘取出，消毒后置于含有相应抗生素的MS培养基上进行发根培养；步骤（7），发状根愈伤组织培养：将步骤（6）中从叶盘边缘长出的发状根切下，置于含有6‑苄基腺嘌呤6‑BA、萘乙酸NAA植物激素与相应抗生素的MS分化培养基中进行分化愈伤组织培养；步骤（8），分化芽培养：将步骤（7）中已有分化芽形成的愈伤组织切下，置于含有相应抗生素MS培养基上进行培养，待愈伤组织上分化芽培养长至2‑4cm高；步骤（9），再生植株生根培养：将步骤（8）中分化芽切下，插入含有相应抗生素的MS培养基上进行生根培养，即得到发根农杆菌介导转化PDS基因的烟草红花大金元再生植株。