[发明专利]一种避孕的工程菌株栓塞和胶囊的制备方法

摘要

本发明公开一种避孕的工程菌株栓塞和胶囊的制备方法，其特征是利用减毒鼠伤寒沙门氏菌胞内侵袭的特性，携带人源毒素DNase I达到杀伤精子的作用。其特点通过与精子细胞结合，减弱精子的活力甚至将精子细胞杀死，实现避孕的作用，制剂形式为阴道栓塞，制作简单，使用方便，成本较低。

主权项

1.一种避孕的工程菌株栓塞和胶囊的制备方法，其特征在于：步骤如下：一、Abvec‑Igk‑DNase I重组质粒构建：1、以pET302‑DNAse I为模板，以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4序列为引物，经PCR扩增获得SEQ ID No.1所示的DNase I片段；2、采用OMEGA质粒小提试剂盒，提取Abvec‑Igk(SEQ ID No.2)质粒；3、酶切Abvec‑Igk，DNase I酶切体系如下，总体系为25μL，37℃酶切4h；体系：质粒2μg、Buffer 2.5μL、Age I 0.8μL、Bsiw I 0.8μL，剩余部分用去离子补足；4、酶切产物纯化后，采用T4连接酶连接到Abvec‑Igk质粒中；5、酶连酶连体系如下，总体系10μL，16℃过夜；体系：Buffer 2.5μL、T4Ligase 0.5μL、载体：目的片段＝1:5，剩余部分用去离子补足；6、转化(1)从‑80℃冰箱中取出100μL Top 10感受态细胞悬液，冰上解冻；(2)加入2μL质粒溶液，质粒浓度不低于200ng/μL，轻轻摇匀，冰上放置30min；(3)42℃水浴中热激60s后迅速置于冰上冷却2‑4min；(4)向管中加入800μL SOC培养基，混匀后37℃，180rpm振荡培养1h，使菌体恢复正常生长状态，4000rpm，离心1min，弃上清800μL，留100μL菌液，混匀；(5)将上述菌液混匀后，取100μL涂布于含300ng/μL氨苄抗生素的LB平板上，正面向上放置30min，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16‑24h，挑取单克隆；(6)送出测序；(7)测序成功后，采用OMEGA质粒小提试剂盒提取重组质粒Abvec‑Igk‑DNase I，保存备用；二、Abvec‑Igk‑DNase I电转减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP200091、VNP20009感受态细胞制备(1)取‑80℃冻存的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009接种于5mL的LB培养基中，37℃过夜培养；(2)将获得菌液按照1％接种于LB培养基扩大培养，37℃振荡培养至菌体OD600值为0.5，收集备用；(3)将以上收集的菌体培养物冰浴20min，5000rpm，4℃，离心10min，收集菌体；(4)用20mL冰冷的15％甘油重悬，冰浴10min，5000rpm，4℃，离心10min，收集菌体；(5)沉淀再次用冰冷的15％甘油重悬，冰浴10min，5000rpm，4℃，离心10min，收集菌体；(6)用2mL冰冷的10％甘油重悬细胞，冰浴10min后使用；2、减毒鼠伤寒沙门菌VNP20009电转化(1)取2μL重组质粒，浓度不低于150ng/μL，与上诉方法制备的50μL冰冷的减毒鼠伤寒沙门菌VNP20009感受态细胞悬液轻轻混匀后，加入预冷的间距0.1cm电击杯中，置于冰上静置5min，设置条件为1800V，200Ω，25μF；(2)电击完毕后，迅速将电击杯中的液体吸入到离心管中，同时加入800μL的SOC培养基，37℃振荡培养1.5h，取100μL转化产物涂布在含有氨苄抗性的LB平板培养基上，37℃倒置培养24‑36h，筛选阳性克隆子；三、工程菌株的冻干：将筛选出的工程菌株Abvec‑Igk‑DNase I‑VNP20009进行二次活化，然后以10％牛奶、6％海藻糖及2％明胶混合液重悬菌体，‑80℃冻存后进行真空冷宫干燥；四、微胶囊的制备：选择海藻酸钠为囊材，以果胶为辅材，果胶液浓度为2％，果胶液与工程菌株液体积比1:1,海藻酸钠与果胶质量比2:1，CaCl2浓度为0.3mol/L；微胶囊直径为1‑2mm；五、工程菌株栓塞制备方法：将上述工程菌株冻干粉或微胶囊包裹于具有良好生物兼容性的无生物毒性的薄膜上，通过塞入女性阴道部达到菌体的释放和女性避孕。