[发明专利]一种快速构建CRISPR/Cas9基因编辑载体库的方法在审
| 申请号： | 201811348105.0 | 申请日： | 2018-11-13 |
| 公开（公告）号： | CN109853046A | 公开（公告）日： | 2019-06-07 |
| 发明（设计）人： | 张建铎;李雪梅;陈章玉;杨光宇;向海英;曾婉俐;张涛;高茜;宋春满;许力;蒋佳芮;邓乐乐;杨文武;贾凌;夏庆友 | 申请（专利权）人： | 云南中烟工业有限责任公司 |
| 主分类号： | C40B50/06 | 分类号： | C40B50/06;C40B40/06;C40B40/08;C12N15/70 |
| 代理公司： | 昆明正原专利商标代理有限公司 53100 | 代理人： | 金耀生;亢能 |
| 地址： | 650231 *** | 国省代码： | 云南;53 |
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| 摘要： | 本发明是一种快速构建CRISPR/Cas9基因编辑载体库的方法，包括以下步骤：设计特异性sgRNA；人工合成寡核苷酸DNA，并分别在上下游引物的5’端加入粘性末端DNA碱基；DNA寡核苷酸双链退火，形成双链sgRNA；利用T4/T7 DNA连接酶将双链sgRNA连接至酶切线性CRISPR/Cas9质粒中；将连接产物转化大肠杆菌提取质粒后得到编辑载体库。本发明利用双链退火原理构建了一种规模化基因编辑载体构建的方法，具有很好的正确率、覆盖度和均一性，可通过一次操作实现成百上千个基因编辑载体的构建，大幅提高载体构建效率，对于各物种基因功能研究和种质资源开发都具有重要意义。 | ||
| 搜索关键词： | 双链 载体库 基因 快速构建 载体构建 构建 质粒 人工合成寡核苷酸 退火 大肠杆菌 功能研究 连接产物 退火原理 物种基因 一次操作 粘性末端 种质资源 重要意义 覆盖度 规模化 均一性 正确率 酶切 引物 转化 开发 | ||
【主权项】：
1.一种快速构建CRISPR/Cas9基因编辑载体库的方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤（1）、基于编辑位点设计特异性sgRNA，并以G碱基开头NGG碱基结尾，长度为20‑25nt；步骤（2）、人工合成步骤（1）中成对互补的寡核苷酸DNA，并分别在上下游引物的5’端加入粘性末端DNA碱基；步骤（3）、将步骤（2）中的上下游DNA寡核苷酸双链退火，形成双链sgRNA；步骤（4）、利用T4/T7 DNA连接酶将双链sgRNA连接至酶切线性CRISPR/Cas9质粒中；步骤（5）、将步骤（4）的连接产物转化大肠杆菌，得到编辑载体库。
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