[发明专利]一种CD163基因编辑的猪胚胎成纤维细胞系的制备及应用

摘要

本发明涉及细胞基因工程的技术领域，特别是涉及一种CD163基因编辑的猪胚胎成纤维细胞系的制备及应用，其可以减少外援遗传物质的携带，并且可以减少其他生物学功能缺失；包括以下步骤：（1）Cas9蛋白的表达；（2）Cas9蛋白的纯化；（3）sgRNA引导序列的设计；（4）体外转录；（5）猪胚胎成纤维细胞核转化；（6）细胞稀释；（7）分隔筛选；（8）扩大培养；（9）收集鉴定，本发明的细胞系可作为体细胞核移植的供体，用于转基因猪的制备。

主权项

1.一种CD163基因编辑的猪胚胎成纤维细胞系的制备，其特征在于，包括以下步骤：（1）Cas9蛋白的表达：将Cas9基因克隆到pET28‑b(+)载体上，在E.coliRosetta中表达Cas9重组蛋白；（2）Cas9蛋白的纯化：使用Ni Sepharose High performance用Qsepharose分离，在pH为7.5的20mM HEPES、500mM KCl、1mM TCEP、10%glycerol的缓冲液中透析，用Ultracel 100K柱子浓缩，获得纯化的Cas9重组蛋白；（3）sgRNA引导序列的设计：在Ensembl的数据库中查找CD163基因编码序列，选取CD163受体胞外第5个结构域SRCR5的第7个外显子，并在其上下游设计sgRNA引导序列；（4）体外转录：将sgRNA引导序列插入DraI酶切的pDR274载体，用MEGAcript^TM T7 High Yield transcription Kit进行体外转录，获得的sgRNA，并经MEGAclear^TM Kit Purification of Transcription Reactions纯化；（5）猪胚胎成纤维细胞核转化：混合90‑110pmol Cas重组蛋白和纯化后的110‑130pmol sgRNA，室温放置10分钟，加入到预先混合有20µL Amaxa P3 Primary Cell 4D‑Nucleofector Kit的核转化溶液的2×10⁵成纤维细胞中，用程序CM‑138在Amaxa 4D‑Nucleofector中进行细胞核转化；（6）细胞稀释：用培养基将转化后的细胞稀释成7‑8个细胞/mL；（7）分隔筛选：分别取200µL稀释后的细胞加入96‑孔板中的各个孔中，使每个孔的细胞数为1到2个，并在显微镜下进行筛选，筛选出含单个细胞的孔；（8）扩大培养：待还有单个细胞的孔中单细胞长成细胞克隆后，移到12‑孔板中进行扩大培养；（9）收集鉴定：待扩大培养完成后，收集细胞，鉴定基因敲除情况，获得CD163双等位基因敲除的猪胚胎成纤维细胞系。