[发明专利]一种肉牛肌肉细胞氧化损伤模型构建方法及应用

摘要

本发明提供了一种肉牛肌肉细胞氧化损伤模型构建方法及应用，属于细胞生物学技术领域。其技术方案为：一种肉牛肌肉细胞氧化损伤模型构建方法，包括以下步骤：配制细胞培养液、分离肉牛肌肉组织、培养肉牛肌肉细胞和氧化损伤模型构建参数的获取。本发明的有益效果为：本发明以分离的肉牛肌肉细胞为研究对象，采用过氧化氢建立肉牛肌肉细胞氧化损伤模型，为牛肉品质的降低和营养调控机理研究提供材料，减少后续试验的研发成本；建立的肉牛肌肉细胞氧化损伤模型可为牛肉品质的调控机理研究及饲料抗氧化活性物质的开发提供机理研究材料，直接应用本模型大大缩短了研发成本和时间。

主权项

1.一种肉牛肌肉细胞氧化损伤模型构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：配制细胞培养液：将50‑60份（体积份数）胎牛血清（FBS）、2‑3份（体积份数）青链霉素混合液溶解在450‑500份（体积份数）细胞培养液中，经过0.22微米滤膜过滤后分装到灭菌的离心管中，每管40‑45毫升，放置4℃保存，细胞培养前0.5‑1小时将培养液放在37℃水浴锅中预热，得细胞培养液；步骤二：分离肉牛肌肉组织：剪取成年肉牛腹侧肌肉组织10g‑20g，用无菌生理盐水冲洗2‑3遍，迅速放在100mL含1‑2%青链霉素液的磷酸盐缓冲液（PBS）的样品瓶中，封口膜封口后低温运输，在1‑2小时内带回实验室；在无菌超净台内将肌肉组织从样品瓶中取出后放在无菌平皿中，利用体式显微镜剔除筋膜及多余脂肪组织，再用PBS冲洗3‑5遍，之后用眼科剪刀将肌肉组织剪碎至乳糜状；步骤三：培养肉牛肌肉细胞：用吸管吸取乳糜组织均匀放在培养瓶底壁，然后翻转培养瓶加入配制好的细胞培养液，将培养瓶平放入培养箱中，30‑40分钟后翻转培养瓶，让培养液慢慢浸没培养瓶底壁的乳糜组织，并重新将培养瓶放回培养箱继续培养38‑48小时后细胞贴壁生长，5‑6天后有80%‑90%细胞贴壁；得到肌肉细胞：步骤四：氧化损伤模型构建参数的获取：将分离得到的贴壁肌肉细胞消化后制备细胞悬着液，调整细胞悬着液的细胞浓度为5×104个/mL，将细胞悬着液接种于96孔板中，在培养箱中培养24小时，然后更换为H2O2（0，50，100，150，200，250，300，350，400，450μM）培养液处理24小时，利用Cell Counting Kit‑8试剂盒检测细胞存活率，当H2O2升至300μM时，细胞存活率降至60%左右，继续提高浓度细胞发生大量死亡；另将5×104个/mL的细胞悬着液接种于25 cm2培养瓶中，待细胞汇合至80%时，更换为H2O2（0，50，100，150，200，250，300，350，400，450μM）培养液处理24小时，收集细胞，检测超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）、蛋白质羰基（PC）和8‑羟基脱氧鸟苷（8‑OHG），发现SDO和CAT活性先升高后降低，MDA、PC和8‑OHG逐渐升高；得出300μM H2O2为氧化损伤模型的有效作用浓度。