[发明专利]一种用于鉴别近缘微生物的核苷酸片段的筛选方法

摘要

本发明公开了一种用于鉴别近缘微生物的核苷酸片段的筛选方法，该方法是将目标微生物的全基因序列利用电子剪切技术剪切成含重叠区的核酸小片段；核酸小片段的fasta文件在NCBI NT数据库中比对；得到命中表Ⅰ，删除重复序列，进而获得命中核酸序列；命中核酸序列Ⅰ与含重叠区的核酸小片段进行比对，获得非命中核酸序列；重复上述步骤一次，设计PCR引物，提取目标微生物菌株所在属或近缘属的菌株10种以上的基因组总DNA，构建核酸池，PCR扩增验证。本发明提供的用于近缘菌株鉴别的特异性核酸筛选方法能够高效率地大量获得目的微生物菌株的特异性核酸序列，实验结果的可重现性极高，简化了整个实验过程，具有良好的适用性。

主权项

1.一种用于鉴别近缘微生物的核苷酸片段的筛选方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：(1)获得目标微生物的全基因序列；(2)利用splitter在线软件的电子剪切技术，将目的菌株的基因组序列剪切成含重叠区的核酸小片段；(3)将步骤(2)得到含重叠区的核酸小片段的fasta文件在NCBI NT数据库中比对；(4)步骤(3)比对后得到命中表Ⅰ，删除命中表Ⅰ中的重复序列，进而获得命中核酸序列Ⅰ；(5)将步骤(4)得到的命中核酸序列Ⅰ与步骤(2)得到的含重叠区的核酸小片段进行比对，获得非命中核酸序列Ⅰ；(6)将步骤(5)中获得的非命中核酸序列Ⅰ在NCBI NT数据库中再次进行比对，获得命中表Ⅱ，删除命中表Ⅱ中的重复重复序列，进而获得命中核酸序列Ⅱ；(7)重复步骤(5)，将步骤(6)获得的命中核酸序列Ⅱ与步骤(2)得到的含重叠区的核酸小片段进行比对，获得非命中核酸序列Ⅱ，该非命中核酸序Ⅱ列即为可能的目标微生物的菌株特异性核酸片段；(8)以步骤(7)获得的可能的目标微生物的菌株特异性核酸片段为模板，设计PCR引物；(9)提取目标微生物菌株所在属或近缘属的菌株10种以上的基因组总DNA，构建核酸池；(10)分别以目标微生物菌株的基因组DNA和步骤(9)获得的核酸池为模板，利用步骤(8)设计的引物进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖电泳检测；若以目标微生物菌株的基因组DNA为模板的PCR检测为阳性，且以步骤(9)获得的核酸池为模板的PCR检测为阴性的引物对应的核酸片段，即为用于目标微生物菌株鉴别的特异性核酸片段。