[发明专利]一种功能性κ-卡拉胶寡糖的酶解制备方法

摘要

本发明提供一种功能性κ‑卡拉胶寡糖的酶解制备方法，属于生物工程领域。以麒麟菜为原料采用高温水提法提取卡拉胶，利用发酵制备获得的κ‑卡拉胶裂解酶降解卡拉胶制备κ‑卡拉胶寡糖。本发明通过开发可生物降解卡拉胶多糖的κ‑卡拉胶裂解酶，再利用酶工程技术取代传统的化学降解法制备κ‑卡拉胶寡糖，使不易被人体吸收利用的高黏度多糖降解成富含生理活性的卡拉胶寡糖，以及一些小分子活性物质，实现红藻资源的高值化利用。

主权项

1.一种功能性κ‑卡拉胶寡糖的酶解制备方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：（1）卡拉胶的提取：以麒麟菜为原料提取卡拉胶，工艺条件为：料液比1:60w/v、温度100℃、pH7、水提时间3 h；（2）κ‑卡拉胶裂解酶的开发及发酵制备：以Zobellia sp.基因组DNA为模板，克隆出κ‑卡拉胶酶κ‑car16基因全长1638 bp，序列如SEQ ID NO.1所示，构建重组质粒pPICZα‑car‑16；将重组质粒pPICZα‑car‑16经线性化、电转化转入毕赤酵母X33菌株中，经Zeocin抗性筛选得到转化子，接种至BMGY液体培养基中培养48 h，再转接至BMMY培养基中；添加甲醇诱导表达，添加量为1%v/v，每12 h添加一次，每24 h取1 mL发酵液，发酵液于4℃、12000 rpm条件下离心5 min，取上清液检测κ‑卡拉胶酶活力，在144 h酶活力达到最高，为11.27 U/mL；收集上清液即为发酵粗酶液；（3）κ‑卡拉胶寡糖的酶解制备：卡拉胶用相应pH的PBS缓冲液配成一定浓度的底物，溶解均匀，加入步骤（2）获得的酶液，在一定温度条件下振荡反应一定时间，立即沸水灭酶5 min，13000 rpm离心5 min，上清加乙醇溶液至终浓度为70%，4℃过夜，13000 rpm离心5 min，去沉淀，过滤，上清45℃旋蒸近干，获得κ‑卡拉胶寡糖。