[发明专利]一种近岸海水中沙门氏菌的检测方法

摘要

本发明公开了一种近岸海水中沙门氏菌的检测方法，包括如下步骤：(1)扩增目的片段；(2)构建标准质粒模板；(3)建立Q‑PCR定量标准曲线；(4)环境样品沙门氏菌测定。本发明的优点：实时快速，缩短了检测时间，由原方法的10‑12天，缩短为1天，在建立Q‑PCR定量标准曲线的情况下仅需3‑4个小时；克服了原方法无法测定不可培养沙门氏菌的问题，提高了鉴别的准确度。

主权项

1.一种近岸海水中沙门氏菌的检测方法，其特征是包括如下步骤：(1)扩增目的片段A.针对沙门氏菌特有的沙门氏菌侵袭蛋白毒力基因设计用SEQ ID NO.1所示的上游引物和用SEQ ID NO.2所示的上游引物；B.以阳性对照沙门氏菌获得的DNA为模板，进行PCR扩增，2×PCR Master Mix 13μL、ddH2O 9μL、10μM所述上游引物1μL、10μM所述下游引物1μL、DNA 1μL；PCR程序：95℃预变性5min；95℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸40s，35个循环；72℃终延伸10min；C.对PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测，并切胶回收目的条带中的DNA片段；(2)构建标准质粒模板使用PCR仪将切胶回收的DNA片段经纯化后与PGM‑18载体在16℃下恒温连接；连接结束后，取10μL加入含100μL大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞的1.5mL离心管中，混匀冰浴30分钟，42℃水浴热激180s，冰浴1min后加入1mL LB液体培养基，在37℃，180rpm，振荡培养2h；10000rpm离心2min，去除上清液，将沉淀吸打混匀，取100μL涂布于含有50μg/mL氨苄青霉素的LB固体选择培养基上，封口后37℃倒置培养过夜；用无菌牙签随机挑取单菌落15个，在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中震荡培养2h，得菌液，以菌液为模板，采用载体专用引物：SEQ ID NO.3所示的上游引物M13‑47，SEQ ID NO.4所示的下游引物RV‑M，进行PCR扩增筛选阳性克隆，并用1％的琼脂糖凝胶电泳检测阳性克隆；将阳性克隆对应的菌液，在5mL含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养液中过夜培养；提取质粒并经测序验证，得到标准质粒模板；(3)建立Q‑PCR定量标准曲线测定标准质粒模板中质粒浓度，对标准质粒模板用纯水梯度稀释，在3.2×100～3.2×104copies/μL范围内进行Q‑PCR实验，反应体系为：2×SYBR Green QPCR Mix 10μL、ddH2O 7μL、浓度10μM的SEQ ID NO.1所示的上游引物1μL、浓度10μM的SEQ ID NO.2所示的下游引物1μL，梯度稀释后各样品DNA 1μL；Q‑PCR程序：95℃预变性3min；95℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环；反应完成后以Ct值和log拷贝数建立Q‑PCR定量标准曲线；(4)环境样品沙门氏菌测定采用抽滤的方法，将近岸海水用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤，用E.N.Z.A.TM Water DNA Kit试剂盒提取所述微孔滤膜上菌的DNA；将所述DNA进行Q‑PCR实验，反应体系为：2×SYBR Green QPCR Mix 10μL、ddH2O 7μL、浓度10μM的SEQ ID NO.1所示的上游引物1μL、浓度10μM的SEQ ID NO.2所示的下游引物1μL、DNA 1μL；Q‑PCR程序为：95℃预变性3min；95℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环；然后按照Q‑PCR定量标准曲线将Ct值转换成log拷贝数，从而定量环境样品中沙门氏菌的浓度。