[发明专利]柑橘黄龙病三种病原菌实时荧光定量PCR的检测方法

摘要

柑橘黄龙病三种病原菌实时荧光定量PCR的检测方法，包括针对柑橘黄龙病原菌亚洲种、非洲种、和美洲种的3对特异性上下游引物及1条通用TaqMan探针，一对基于植物细胞色素氧化酶的阳性对照引物及1条特异探针。

主权项

1.柑橘黄龙病三种病原菌实时荧光定量PCR的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)引物设计：根据黄龙病病原3个种间16S rRNA差异，设计了针对亚洲种、非洲种、和美洲种的3对特异性上下游引物及1条通用TaqMan探针，同时设计了一对基于植物细胞色素氧化酶的阳性对照引物及1条特异TaqMan探针；2)样品DNA提取：从柑橘叶片中提取DNA；3)荧光定量PCR反应：使用TaqMan探针法，分别在每个反应管中加入荧光定量PCR预混合液，相应基因的上下游引物及探针，模板DNA，在AnalytikJenaqTOWER 2.0荧光定量PCR仪上进行；4)扩增曲线分析；其中步骤3)中，荧光定量PCR反应体系包括：AceQ qPCR Probe Master Mix：10μL；基因特异性上游引物10μmol/L：0.4μL；基因特异性下游引物10μmol/L：0.4μl；TaqMan Probe 10μmol/L：0.2μL；10倍稀释模板DNA：1μL；无RNA酶的灭菌双蒸水：8μL；混合好的反应体系，按照如下扩增条件进行设置：黄龙病菌亚洲种：95℃预变性5min；95℃变性15s，53.4℃退火15s，72℃延伸20s，进行40个循环；在每个循环延伸阶段同步采集荧光，末次72℃延伸7min；黄龙病菌非洲种：95℃预变性5min；95℃变性15s，53.4℃退火15s，72℃延伸20s，进行40个循环；在每个循环延伸阶段同步采集荧光，末次72℃延伸7min；黄龙病菌美洲种：95℃预变性5min；95℃变性15s，53.4℃退火15s，72℃延伸20s，进行40个循环；在每个循环延伸阶段同步采集荧光，末次72℃延伸7min；阳性对照COX基因：95℃预变性5min；95℃变性15s，53.4℃退火15s，72℃延伸20s，进行40个循环；在每个循环延伸阶段同步采集荧光，末次72℃延伸7min；步骤1)所述的设计了针对亚洲种、非洲种、和美洲种的3对特异性上下游引物及1条通用TaqMan探针，是一套用于检测鉴定柑橘黄龙病亚洲种、非洲种、美洲种的引物及TaqMan探针，保证3种病原菌的引物都是特异检测该种病原菌，且不受其他柑橘类常见病原体或内生菌的影响：黄龙病菌亚洲种的特异性上下游引物分别为：HLBasia F：5’‑CCTTACCAGCCCTTGACATGTATA‑3’，HLBasia R：5’‑CAGCCATGCAGCACCTGTGTA‑3’；黄龙病菌非洲种的特异性上下游引物分别为：HLBafrica F：5’‑CTTACCAGCCCTTGACATATGTT‑3’，HLBafrica R：5’‑GCCATGCAGCACCTGTATGAAA‑3’；黄龙病菌美洲种的特异性上下游引物分别为：HLBamerica F：5’‑TTACCAGCCCTTGACATGGTG‑3’，HLBamerica R：5’‑GCCATGCAGCACCTGTGTGTG‑3’；通用TaqMan探针序列为：HLBprobe：5’‑FAM‑GACGATATCAGAGATG‑BHQ1‑3’；步骤1)所述的一对基于植物细胞色素氧化酶(COX)的阳性对照引物及1条特异TaqMan探针，是一对用于评估DNA提取物的质量的柑橘内源基因COX引物及TaqMan探针：COX基因基因特异性上游引物的序列：COX f：5’‑GTATGCCACGTCGCATTCCAGA‑3’，COX基因基因特异性下游引物的序列：COX r：5’‑GCCAAAACTGCTAAGGGCATTC‑3’，COX基因TaqMan探针序列：COX probe：5’‑VIC‑ATCCAGATGCTTACGCTGG‑BHQ1‑3’。