[发明专利]成纤维前体细胞培养及其鉴定方法

摘要

本发明涉及一种成纤维前体细胞培养及其鉴定方法，按照先后顺序包括以下步骤：TAF的培养；RNA提取和PT‑PCR；流式细胞仪检测；免疫荧光检测；诱导分化；克隆成型。本发明对分离得到的TAF细胞做了初步鉴定，并且对裸鼠注射和组织学检查结果显示，本发明得到的大腿皮肤成纤维前体细胞能够产生I型胶原蛋白，促进真皮层的厚度，回复皮肤弹性，并且达到了一次取材、持续扩增的目的，减少了患者的痛苦，具有创伤小，疗效自然、持久等优点。

主权项

1.一种成纤维前体细胞培养及其鉴定方法，按照先后顺序包括以下步骤：(1)：TAF的培养：取人大腿皮肤样品切块后用PBS中冲洗，再加入DMEM培养液，于培养箱中传代培养，以MTT法测定TAF的生长曲线，实验选取P5‑P10代的细胞；(2)：RNA提取和PT‑PCR：提取上述细胞的RNA，取高纯度RNA进行PCR检测，PCR产物再经凝胶电泳分析；(3)：流式细胞仪检测：取P5代TAF细胞冲洗过滤，调整细胞浓度，每管分别加入PE标记的CD90、CD105、同型对照但荧光标记抗体，低温处理后，进行流式细胞仪检测；(4)：免疫荧光检测：将TAF细胞与Brdu共同培养，传代扩增培养，应用抗Brdu的抗体进行检测，将人大腿皮皮肤组织块固定，包埋，切片后，用抗I型胶原的单克隆抗体4℃孵育过夜，再用TITC标记的山羊二抗染色并观察；(5)：诱导分化：取TAF细胞，接种到细胞培养皿中贴壁培养，更换为诱导培养液诱导培养，再更换为维持培养液维持，然后更换为诱导培养液，依次循环，采用油红O染色，再观察；(6)：克隆成型：配制琼脂溶液，灭菌，至于细胞培养箱中静置晒干，取TAF细胞加入DMEM培养基和琼脂溶液中培养，再观察并统计克隆数。